模塊2-項(xiàng)目二食品中一般成分的檢驗(yàn)-資料下載頁(yè)
2025-05-26 12:10本頁(yè)面
【正文】 R R + + H+ R + R 酯化反應(yīng)的醇一般是異丙醇、正丙醇、異丁醇或正丁醇，用鹽酸作為酸性催化劑，?；瘎┩ǔ槿宜狒?、五氟丙酸酐。 氨基酸在衍生過(guò)程中應(yīng)注意三個(gè)方面： ① 由于酯類衍生物的易揮發(fā)性，在蒸發(fā)除去?；噭r(shí)會(huì)有損失，因此在衍生化前就要加內(nèi)標(biāo)； ②氨基酸在高濃度的醇溶液中溶解度較差； ③玻璃表面的硅羥基會(huì)加速 N?；被狨パ苌锏姆纸?，因此反應(yīng)瓶表面需硅烷化處理。 ? 氣相色譜法測(cè)定氨基酸通常采用火焰氫離子檢測(cè)器（ FID）檢測(cè)，由于 FID對(duì)碳?xì)浠衔镉休^高的響應(yīng)，食品中含有的其它有機(jī)酸會(huì)干擾氨基酸的測(cè)定，而需除去；其次實(shí)驗(yàn)用水引入不純含碳物也影響氨基酸的定量。 液相色譜法 柱后衍生法 ? 傳統(tǒng)的氨基酸分析技術(shù)用離子交換色譜分離氨基酸，柱后與茚三酮反應(yīng)。此法需要專門(mén)的氨基酸分析儀。 ? 用茚三酮為衍生化試劑常需要采用雙波長(zhǎng)檢測(cè)，對(duì)儀器要求較高。 柱前衍生法 ? 利用 RPHPLC。 ? 要求將氨基酸在柱前轉(zhuǎn)化為適合于反相色譜分離并能被靈敏檢測(cè)的衍生物。 ? 迄今已報(bào)道的柱前衍生試劑有很多，主要有鄰苯二甲醛（ OPA)、丹酰氯（ DNSCl）、磺酰氯二甲偶氮苯（ DABSCl）和異硫氰酸苯酯（ PITC）等。 直接測(cè)定法 ? 大量氨基酸分析方法建立在柱前和柱后衍生化的氣相色譜和液相色譜之上。雖然這些方法比經(jīng)典的離子色譜方法快速且檢測(cè)限更低，但是這些方法耗時(shí)更長(zhǎng)。當(dāng)使用蒸發(fā)光散射檢測(cè)器（ ELSD）檢測(cè)未衍生化氨基酸所需的樣品預(yù)處理最少，并且可靠和準(zhǔn)確。 6 蛋白質(zhì) 測(cè)定蛋白質(zhì)的方法很多，一般是根據(jù)蛋白質(zhì)的理化特性來(lái)進(jìn)行定量的方法，這些方法大致可分為兩類： 一類是利用蛋白質(zhì)共性的方法，如凱氏法、雙縮脲法等； 另一類是利用蛋白質(zhì)中含有特定氨基酸殘基的方法，如紫外吸收光譜法、色譜法、染色結(jié)合法等。 蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 （ 1）凱氏定氮法 樣品中的蛋白質(zhì)與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白分解，分解的氨與硫酸結(jié)合生成硫酸銨，然后堿化蒸餾使氨游離，用硼酸吸收后再用硫酸或鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定，測(cè)出樣品轉(zhuǎn)化后的氮含量。 （ 2）雙縮脲法 在堿性條件下，銅離子和多肽（至少有兩個(gè)肽鍵）生成的復(fù)合物呈紫紅色，吸收波長(zhǎng)為 540nm，比色所得的吸光度值和樣品中的蛋白質(zhì)含量成正比。這是一種快速蛋白檢測(cè)方法，但其靈敏度較低，比福林 酚法要低 100倍。 （ 3）福林 酚比色法 蛋白質(zhì)與福林 酚試劑反應(yīng)，產(chǎn)生藍(lán)色復(fù)合物。作用機(jī)理是蛋白質(zhì)中的肽鍵與堿性銅鹽產(chǎn)生雙縮脲反應(yīng)，同時(shí)也由于蛋白質(zhì)中存在的酪氨酸與色氨酸同磷鉬酸 磷鎢酸試劑反應(yīng)產(chǎn)生顏色。呈色強(qiáng)度與蛋白質(zhì)含量成正比，是檢測(cè)可溶性蛋白質(zhì)含量最靈敏的經(jīng)典方法。 （ 4）考馬斯亮藍(lán)染料比色法 考馬斯亮藍(lán) G250是一種蛋白質(zhì)染料，與蛋白質(zhì)通過(guò)范德華力結(jié)合，使蛋白質(zhì)染色，在 620nm處有最大吸收值，可用于蛋白質(zhì)的定量測(cè)定。 快速，適合大量樣品的測(cè)定。靈敏度與福林 酚法相似，但不受酚類、游離氨基酸和小分子肽的影響。 （ 5） 280nm紫外吸收法 由于蛋白質(zhì)中存在著含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此具有吸收紫外光的性質(zhì)，在 280nm處，蛋白質(zhì)溶液的光吸收值與其濃度成正比，可作定量測(cè)定。 （ 6）肽鍵紫外吸收法 蛋白質(zhì)溶液在 238nm下均有吸收，其吸收強(qiáng)弱與肽鍵的多少成正比。根據(jù)這一性質(zhì)，可測(cè)定樣品在238nm下的吸收值，與蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液作對(duì)照，求出蛋白質(zhì)含量。本法比 280nm紫外吸收法靈敏。 （ 7）杜馬斯法（燃燒法） 樣品在高溫下（ 700~800oC）燃燒，釋放的氮?dú)庥蓭釋?dǎo)檢測(cè)器（ TCD）的氣相色譜儀測(cè)定。測(cè)得的氮含量轉(zhuǎn)換成樣品中的蛋白質(zhì)含量。 優(yōu)點(diǎn)：可代替凱氏定氮法；不需要任何有害化合物；在 3min內(nèi)完成；適合樣品的批量分析。 缺點(diǎn)：需要儀器價(jià)格昂貴；非蛋白氮也包括在內(nèi)。 蛋白質(zhì)的樣品處理 蛋白質(zhì)的分離、純化對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能研究具有重要意義。蛋白質(zhì)分離技術(shù)是利用蛋白質(zhì)的特性如溶解度、分子質(zhì)量大小、等電點(diǎn)、吸附特性和其它離子的生物親和力等的不同，選擇合適的分離模式并建立最佳的純化方法。常用的分離方法包括沉淀法、色譜法和電泳及毛細(xì)管電泳。 （ 1）沉淀法 利用蛋白質(zhì)在溶液中的不同溶解度。蛋白質(zhì)的溶解度取決于分子中氨基酸的類型和電荷數(shù)，通過(guò)改變緩沖液 pH值、離子強(qiáng)度、介電常數(shù)或溫度而改變蛋白質(zhì)的溶解度。主要使用的沉淀分離技術(shù)有鹽析、等電點(diǎn)沉淀、溶劑分級(jí)分離。 （ 2）透析法 利用半透膜只允許小分子透過(guò)而大分子不能透過(guò)的原理來(lái)分離溶液中的蛋白質(zhì)。通常至少需要 12h。 （ 3）超濾法 采用半透膜在一定壓力下，按照分子質(zhì)量大小分離溶質(zhì)的一門(mén)技術(shù)。與透析相似，但速度快得多。 蛋白質(zhì)分離分析 （ 1）液相色譜法 ? 液相色譜法用于蛋白質(zhì)分離已有數(shù)十年的歷史。所采用的 HPLC法有離子交換色譜、反相色譜、凝膠滲透色譜、親和色譜等。 ? 蛋白質(zhì)的 HPLC檢測(cè)一般采用紫外檢測(cè)或熒光檢測(cè)，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)為 280nm、 254nm或 215nm，蛋白質(zhì)在 215nm處吸收較強(qiáng)，故在該波長(zhǎng)處檢測(cè)靈敏度高，但對(duì)溶劑要求較高；熒光檢測(cè)要求多數(shù)蛋白質(zhì)在檢測(cè)前進(jìn)行衍生化反應(yīng)。 （ 2）電泳分離 其分離原理是混合物中帶電粒子在電場(chǎng)作用下以不同的速度向電荷反相方向電極遷移，從而使混合物中各組分分離。 蛋白質(zhì)的電泳技術(shù)有很多種，包括區(qū)帶電泳、等電聚焦電泳、毛細(xì)管電泳等。 （ 1）聚丙烯酰胺凝膠電泳 ? 蛋白質(zhì)電泳中最常見(jiàn)的是以聚丙烯酰胺凝膠為介質(zhì)的區(qū)帶電泳。蛋白質(zhì)通過(guò)水溶性緩沖液，在凝膠介質(zhì)中遷移而得到分離。 ? 進(jìn)行電泳分離前，將溶解于適當(dāng) pH值緩沖液中的蛋白質(zhì)樣品加至凝膠的頂部，溴酚藍(lán)示蹤指示劑混合于蛋白質(zhì)溶液中，電泳過(guò)程中這種小分子指示劑遷移在蛋白質(zhì)的前面，用來(lái)觀察分離的過(guò)程。電泳結(jié)束后，凝膠上的區(qū)帶一般采用蛋白質(zhì)染色劑如考馬斯亮藍(lán)或銀染色劑染色，特殊的酶染色或抗體也能用于檢測(cè)蛋白質(zhì)。 ? 十二烷基磺酸鈉（ SDS）是一種陰離子表面活性劑，它能按一定比例與蛋白質(zhì)分子結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的復(fù)合物，其負(fù)電荷遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)了蛋白質(zhì)自有的電荷，從而消除或降低了不同蛋白質(zhì)之間原有的電荷差別，這樣就使電泳遷移率只取決于分子大小這一因素。 ? 聚丙烯酰胺凝膠電泳經(jīng)常用于確定食品中蛋白質(zhì)的組分，如大豆?jié)饪s蛋白和乳清濃縮蛋白產(chǎn)品中不同成分的蛋白質(zhì)，也用于測(cè)定蛋白質(zhì)提取物的純度。 （ 2）等電聚焦電泳 ? 等電聚焦是一種特殊的電泳方法，其凝膠采用具有 pH值梯度的兩性電解質(zhì)。由于兩性電解質(zhì)在分離介質(zhì)中的遷移造成了 pH值梯度，由此可以使蛋白質(zhì)根據(jù)它們各自不同的等電點(diǎn)進(jìn)行分離。 ? 由于蛋白質(zhì)在其等電點(diǎn)時(shí)的溶解度最小，因此當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)順著這一梯度遷移到相當(dāng)于它們的等電點(diǎn)的那個(gè)位置，就在該點(diǎn)停下，由此聚集形成一條蛋白質(zhì)區(qū)帶。不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)聚焦在不同的位置上，只要測(cè)得聚集部位的 pH值，就可得知該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。 ? 應(yīng)用等電聚焦法不僅能測(cè)定蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)，而且能將具有不同等電點(diǎn)的蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離或鑒定。
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