【正文】 Li W, Pi R, Chan HH, Fu H, Lee NT, Tsang HW, Pu Y, Chang DC, Li C, Luo J, Xiong K, Li Z, Xue H, Carlier PR, Pang Y, Tsim KW, Li M, Han Y. J Biol Chem. 2022, 280(18):1817988. 創(chuàng) 新 點 1. 首次證實 JNK是治療 PD的有效靶點 2. 證實 GSK3β是治療 PD的靶點之一 3. 發(fā)現(xiàn)靛玉紅能夠抑制 JNK，對 PD具有治療作用 4. JNK/CDK5/ GSK3β為靶治療 PD 5. 用一種化合物抑制 JNK/CDK5/ GSK3β 我們對完成此項目充滿信心！ 謝 謝！ Mithramycin A, a SP1DNA binding inhibitor, attenuates bim upreguation by activity deprivation in CGNs. (A) Mithramycin A attenuates the upregulation of BimEL induced by activity deprivation in a dose dependent manner. CGNs were placed in 25K or 5K media in the absence or presence of mithramycin A at the indicated concentrations for 6 h. BimEL expression was assessed by Western blot as described in (A). Results shown are representative of four separate experiments. (B) Mithramycin A inhibits the increase in bim mRNA level in a dosedependent manner. Neurons were treated as described in (A), bim and actin mRNAs were determined by RTPCR, Results shown are representative of five separate experiments. (C) Mithramycin A suppresses the activation of bim promoter induced by activity deprivation. Neurons were cotransfected with bimLuc and pEFRL for 8 hr. Luciferase activities were measured as described in , The experiments were repeated three times with duplicates for each treatment. The data represent 177。 . of three experiments. 參 考 文 獻 1. Leyu Shi , Shoufang Gong, Zhongmin Yuan , Chi Ma, Yanling Liu,Chuanfu Wang , Wenming Li, Rongbiao Pi, Shoujian Huang, Ruzhu Chen , Yifan Han , Zixu Mao, and Mingtao Li. Activity deprivationdependent induction of the proapoptotic BH3only protein Bim is independent of JNK/cJun activation during apoptosis in cerebellar granule neurons. Neurosci Lett. 2022, 375： 7－ 12. 2. Wenya Wang, Leyu Shi, Yuanbin Xie, Chi Ma, Wenming Li, Xingwen Su, Shoujian Huang, Ruzhu Chen, Zhenyu Zhu, Zixu Mao, Yifan Han and Mingtao Li. SP600125, a new JNK inhibitor, protects dopaminergic neurons in the MPTP model of Parkinson’s disease. Neurosci Res 2022； 48:195202 實事求是、追求真理的人文精神 Dr. Jonathan Ham以撤 NGF的交感神經元為模型觀察到JNK/cJun[10]和 PI3K/Akt/ FKHRL1通路參與 Bim的上調 [12]，而我們以撤鉀處理 CGNs為模型觀察到，這兩條通路不參與Bim的上調。顯然，我們的研究結果不支持 Dr. Ham的結論。但是， Dr. Ham讀了我們的文章初稿之后，在提出中肯意見的同時，稱我們的實驗結果非常清楚并對我們的上述結論表示認同 (Overall your results are clear and suggest that altering the KCl concentration in CGNs induces the bim promoter by a mechanism that does not involve JNK / cJun or FOXO factors)。Dr. Ham這種嚴謹?shù)目茖W態(tài)度令人欽佩，值得學習（尊敬的評審專家，如有必要，本人可以將 Dr. Ham的 Email原件轉發(fā)給您）。 工作基礎 ： 本項目是在原工作基礎上的繼續(xù)和深入。近五年，本人共發(fā)表了 12篇 SCI論文，其中作為第一作者兩篇；通訊作者四篇（見工作基礎）。研究方向主要集中在神經元凋亡的信號轉導和基因調控。本課題組在研究 JNK/cJun通路靶基因時 ,發(fā)現(xiàn) “ 促凋亡蛋白 bim上調不依賴 JNK/cJun”。 我們首次報道了神經元凋亡時 JNK/cJun不參與 bim的上調 [1]，隨后，我們又以可靠的證據(jù)揭示了 PI3K/Akt/ FKHRL1也不介導 bim的上調 (未發(fā)表資料 )。最近，對 bim的調控研究又取得了突 破性的進展，即發(fā)現(xiàn)了 SP1調控 bim的轉錄機制 (見立項依據(jù) )。這些研究工作改變了以往的觀點 ,也是本項目重要的立項依據(jù)之一。 因此，我們具有完成本項目的切實可行的、扎實的前期工作基礎。 課 題 組 成 員 交流與合作 ： 我們與國際同行建立了良好的交流渠道， 與毛子旭(Zixu Mao, Associate Professor， Brown University， 現(xiàn)在Emory University)、韓怡凡 (Yifan Han, Associate Professor，Hong Kong University of Science and Technology)一直保持密切合作關系，我們已經共同發(fā)表了多篇 SCI論文（見工作基礎中的參考文獻），在人員、信息、試劑和載體等多方面真正做到了互通和互惠。本人將此視為完成本項目的寶貴條件之一。 負顯性 SP1腺病毒 (AddnSP1)載體 的構建、擴增、純化和保存 為了達到在 mRNA 和蛋白質水平（而不僅僅是人工的報道基因水平）觀察 dnSP1是否能夠抑制撤鉀誘導 bim基因的上調的目的，必須保證 dnSP1導入 CGNs有較高的導入率。現(xiàn)有質粒轉染 CGNs方法的轉染率只能達到 %，而在方法得當?shù)那闆r下（見后）腺病毒的感染率可達 70－ 80%[1]。因此，dnSP1的腺病毒載體 AddnSP1的構建是采用 RT－ PCR和 Western blot分析 bim的 mRNA和蛋白質的前提。 。 腺病毒的擴增和純化按本人報道的進行 [1]。腺病毒的活性高低是決定能否對 CGNs達到 70－ 80％感染率的關鍵，而正確的腺病毒保存條件又是其活性高低的決定因素。我們曾經研究過儲存條件對腺病毒感染 CGNs的影響，并制定了腺病毒的最佳儲存條件，即小量分裝后置于－ 20?C/20%甘油或－80?C/50%甘油，一月內可保證感染率在 7080%。 基本方法 大鼠小腦顆粒神經元培養(yǎng)、 Western blot、RT－ PCR、鈣磷沉淀法轉染基因、轉基因神經元的凋亡分析、報道基因表達分析、免疫沉淀等基本方法均按我們報道 [1, 2, 3, 4, 5, 6]的進行。