cr的原理與應(yīng)用ppt課件-資料下載頁
2025-05-12 13:49本頁面
【正文】 R Q Extension Step 5’ 3’ 1. Strand Displacement Taq Q R 5’ 3’ Q Taq R 5’ 2. Cleavage 3. Polymerization Complete 5’ 3’ Taq R 5’ 4. Detection 5’ 3’ Taq R 5’ l R Cleavagebased assay: TaqManTM Cycle 一般而言，熒光擴(kuò)增曲線擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段： 熒光背景信號(hào)階段 , 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期 。在 熒光背景信號(hào)階段 ，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，我們無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在 平臺(tái)期 ，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加。 PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，所以根據(jù)最終的 PCR 產(chǎn)物量不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在 熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段 ， PCR 產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。 為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT 值。 熒光閾值 是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，但一般我們將熒光域值的缺省設(shè)置是 315 個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值 。 Ct value and RealTime Quantitative PCR Theory ?Ct值 (Threshold Cycle) PCR擴(kuò)增過程中，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過基線值（進(jìn)入指數(shù)增長期）時(shí)的循環(huán)數(shù)。 principle of quantitative realtime PCR… use when rather than how much fluorescent signal? PCR cycles? Low (high copy no.) High CT (low copy no.) realtime PCR amplification plots (7 x 10fold dilns. + NTC) End point (not quantitative) threshold of detection CT Threshold Cycle, CT ? Correlates strongly with the starting copy number ? Is linear with the log of starting copy number The least? Which one has the most? TaqMan系統(tǒng)的一個(gè)例子 10ng Titrate a template。 10, 1, , , ng ? 模板起始濃度越高， Ct值越小 ? Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系 Ct值與模板起始濃度的關(guān)系 ? 如果模板濃度增加 1倍， Ct值就提前 1個(gè)循環(huán)到達(dá) ? 如果模板濃度減少 1倍， Ct值就滯后 1個(gè)循環(huán)到達(dá) 利用定量 PCR進(jìn)行 SNP定型 雜合子 野生性純合子 突變純合子 Taqman的優(yōu)缺點(diǎn) ? 單一熒光系統(tǒng)中 – 不能在同一管中進(jìn)行多片斷擴(kuò)增 – 不同的基因必須在不同的試管中 – 管之間的精確度跟多熒光系統(tǒng)同等的精確和 可靠 – 靈敏度高，定量方便 – 費(fèi)用高 ? 多種熒光提供儀器價(jià)格比較貴 定量 PCR相關(guān)的近年來 國際學(xué)術(shù)刊物上發(fā)表的論文數(shù) 050100150200250300350400450系列11996 1997 1998 1999 2022 2022年已經(jīng)達(dá)到3000篇 PCR的應(yīng)用領(lǐng)域 生物學(xué)領(lǐng)域幾乎無處不用 ? 基因、 DNA片段的克隆 ? 人工基因構(gòu)建 ? DNA序列測定 ? 基因定點(diǎn)突變 ? 基因型（突變）檢測， ? SNP分析，遺傳背景分析 ? 生物物種鑒定，系統(tǒng)進(jìn)化研究 ? 基因表達(dá)量研究 （ realtime PCR） / 基因表達(dá)譜研究 （ DNA chip, SAGE） 醫(yī)學(xué)領(lǐng)域 ? 疾病基因檢測 / 遺傳病的產(chǎn)前診斷 ? 致病病原體的檢測 ? 腫瘤治療中癌基因的檢測 會(huì)推廣到大部分疾病治療前的檢測 ? DNA指紋、個(gè)體識(shí)別、親子關(guān)系鑒別、法醫(yī)物證 ? 其他 : 動(dòng)、植物檢疫 （轉(zhuǎn)基因動(dòng)植物檢測）
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