現(xiàn)代生物學(xué)方法論ppt課件-資料下載頁
2025-05-12 12:28本頁面
【正文】 3’uucauagcucaagucguaagg5’ 反義鏈 siRNA分子的設(shè)計(jì) 合成時(shí)，可以用 T代替 U降低成本，提高 siRNA分子的穩(wěn)定性。 體外轉(zhuǎn)錄合成 siRNA 成本低，抑制效果明顯優(yōu)于化學(xué)合成 實(shí)驗(yàn)室通常采用 T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄合成 siRNA 采用 RNA聚合酶 III啟動(dòng)子表達(dá) siRNA分子 ?載體表達(dá)法 ?PCR方法 采用 RNAseIII制備 siRNA分子 ?首先在體外以長為 2001000bp的 cDNA為模板轉(zhuǎn)錄合成正義與反義 的單鏈 RNA分子， ?然后通過退火形成長的 ds分子，再用 Dicer核酸酶進(jìn)行切割得到 siRNA分子的混合物，通過純化取出沒有被切割的雙鏈 RNA分子 和 DNA模板， siRNA分子可以用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞。 優(yōu)點(diǎn)：不需要大量的合成并篩選有效的 siRNA作用位點(diǎn) 缺點(diǎn)：可能會(huì)產(chǎn)生非特異性的基因沉默 RNAi實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)： 1 必須采取措施防止和消除 RNase的污染。 2 在進(jìn)行 RNA干涉實(shí)驗(yàn)之前，應(yīng)該考慮到靶基因產(chǎn)物的 半衰期及其在細(xì)胞中的豐度和表達(dá)調(diào)控機(jī)制。 RNAi不 適合研究具有長半衰期的蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的功能。 3 RNAi不適合有些酶基因的功能研究。 4 用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 siRNA分子的濃度同靶基因的特性 和細(xì)胞類型有關(guān)。用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞的 siRNA分子的濃度 一般在 30100nmol/L之間。 5 不同細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率是不同的，對于不同的轉(zhuǎn)染試劑 和培養(yǎng)細(xì)胞需要通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定轉(zhuǎn)染條件。生長狀況 良好的細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率要比生長狀況較差的細(xì)胞要高。 6 盡量采用傳代次數(shù)較少的，一般采用傳代次數(shù)在 50代以內(nèi)的細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。 7 細(xì)胞密度對轉(zhuǎn)染效率的影響，對貼壁細(xì)胞來說，最佳轉(zhuǎn)染密 度為 3070%。 8 用適當(dāng)?shù)年栃?siRNA對照優(yōu)化轉(zhuǎn)染和檢測條件。看家 基因是較合適的陽性對照。要有 12個(gè)陰性對照來確定 靶 siRNA對靶基因抑制作用的特異性。 9 抑制靶基因后，先觀察細(xì)胞表型的變化，然后通過 免疫印跡與免疫熒光檢測細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)水平的變化。 若沒有特異的靶蛋白抗體，可以通過 Northern印跡確定 mRNA水平的變化。 10 體外合成的 siRNA對靶基因的抑制作用是瞬時(shí)的，細(xì)胞 中受到抑制的蛋白一般在轉(zhuǎn)染 57天后，即經(jīng)過 710個(gè)細(xì)胞 增殖周期就可以逐漸恢復(fù)至正常水平。 11 siRNA不能抑制靶基因表達(dá)時(shí)，首先要查明所采用的 基因序列和試驗(yàn)用的細(xì)胞系是否來源于同一物種，然后 檢查所采用的基因序列是否可靠。 啟動(dòng)子技術(shù) ? 啟動(dòng)子與基因表達(dá)調(diào)控 ? 啟動(dòng)子的預(yù)測技術(shù) ? 轉(zhuǎn)錄活性的測定 非編碼 RNA ? 非編碼 RNA的概念與種類 ? 非編碼 RNA的功能 ? 非編碼 RNA的預(yù)測與鑒定 ? 研究非編碼 RNA的功能的方法 ? 非編碼 RNA技術(shù)應(yīng)用的實(shí)例 microRNA ? miRNA的分離與發(fā)現(xiàn) ? miRNA的特征與功能 ? miRNA的調(diào)控機(jī)制 ? miRNA靶位點(diǎn)預(yù)測 ? miRNA應(yīng)用的實(shí)例 SELEX技術(shù) 指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù) （ Systematic Evolution of Ligands by Expoial Enrichment) ? SELEX技術(shù)簡介（概念、特點(diǎn)、原理） ? 單鏈 DNA文庫的 SELEX篩選 ? 單鏈 DNA文庫的 SELEX篩選 核酸的生物信息學(xué) 1 核酸序列數(shù)據(jù)庫 ? 三大核酸序列數(shù)據(jù)庫介紹 ? 三大核酸序列數(shù)據(jù)庫基本結(jié)構(gòu) ? 核酸序列數(shù)據(jù)庫檢索方法 2 核酸序列的分析 ? Blast的使用方法 ? 核酸序列的雙重比對 一 核酸序列數(shù)據(jù)庫 核酸的生物信息學(xué) 二 核酸的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測與核酸的網(wǎng)上資源 1 核酸的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測 ? 方法簡介 ? 常用軟件及使用方法 2 核酸的網(wǎng)上資源 ? 綜合網(wǎng)站介紹 ? 不同領(lǐng)域相關(guān)網(wǎng)站 綜述： 1 RNAi 2 非編碼 RNA 3 合成生物學(xué)
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