現(xiàn)代生物學方法論ppt課件-資料下載頁
2025-05-12 12:28本頁面
【正文】 3’uucauagcucaagucguaagg5’ 反義鏈 siRNA分子的設計 合成時，可以用 T代替 U降低成本，提高 siRNA分子的穩(wěn)定性。 體外轉錄合成 siRNA 成本低，抑制效果明顯優(yōu)于化學合成 實驗室通常采用 T7RNA聚合酶體外轉錄合成 siRNA 采用 RNA聚合酶 III啟動子表達 siRNA分子 ?載體表達法 ?PCR方法 采用 RNAseIII制備 siRNA分子 ?首先在體外以長為 2001000bp的 cDNA為模板轉錄合成正義與反義 的單鏈 RNA分子， ?然后通過退火形成長的 ds分子，再用 Dicer核酸酶進行切割得到 siRNA分子的混合物，通過純化取出沒有被切割的雙鏈 RNA分子 和 DNA模板， siRNA分子可以用于轉染細胞。 優(yōu)點：不需要大量的合成并篩選有效的 siRNA作用位點 缺點：可能會產(chǎn)生非特異性的基因沉默 RNAi實驗注意事項： 1 必須采取措施防止和消除 RNase的污染。 2 在進行 RNA干涉實驗之前，應該考慮到靶基因產(chǎn)物的 半衰期及其在細胞中的豐度和表達調控機制。 RNAi不 適合研究具有長半衰期的蛋白質在細胞中的功能。 3 RNAi不適合有些酶基因的功能研究。 4 用于轉染細胞的 siRNA分子的濃度同靶基因的特性 和細胞類型有關。用于轉染細胞的 siRNA分子的濃度 一般在 30100nmol/L之間。 5 不同細胞的轉染效率是不同的，對于不同的轉染試劑 和培養(yǎng)細胞需要通過預實驗來確定轉染條件。生長狀況 良好的細胞轉染效率要比生長狀況較差的細胞要高。 6 盡量采用傳代次數(shù)較少的，一般采用傳代次數(shù)在 50代以內的細胞進行轉染。 7 細胞密度對轉染效率的影響，對貼壁細胞來說，最佳轉染密 度為 3070%。 8 用適當?shù)年栃?siRNA對照優(yōu)化轉染和檢測條件?？醇? 基因是較合適的陽性對照。要有 12個陰性對照來確定 靶 siRNA對靶基因抑制作用的特異性。 9 抑制靶基因后，先觀察細胞表型的變化，然后通過 免疫印跡與免疫熒光檢測細胞內的蛋白質水平的變化。 若沒有特異的靶蛋白抗體，可以通過 Northern印跡確定 mRNA水平的變化。 10 體外合成的 siRNA對靶基因的抑制作用是瞬時的，細胞 中受到抑制的蛋白一般在轉染 57天后，即經(jīng)過 710個細胞 增殖周期就可以逐漸恢復至正常水平。 11 siRNA不能抑制靶基因表達時，首先要查明所采用的 基因序列和試驗用的細胞系是否來源于同一物種，然后 檢查所采用的基因序列是否可靠。 啟動子技術 ? 啟動子與基因表達調控 ? 啟動子的預測技術 ? 轉錄活性的測定 非編碼 RNA ? 非編碼 RNA的概念與種類 ? 非編碼 RNA的功能 ? 非編碼 RNA的預測與鑒定 ? 研究非編碼 RNA的功能的方法 ? 非編碼 RNA技術應用的實例 microRNA ? miRNA的分離與發(fā)現(xiàn) ? miRNA的特征與功能 ? miRNA的調控機制 ? miRNA靶位點預測 ? miRNA應用的實例 SELEX技術 指數(shù)級富集的配體系統(tǒng)進化技術 （ Systematic Evolution of Ligands by Expoial Enrichment) ? SELEX技術簡介（概念、特點、原理） ? 單鏈 DNA文庫的 SELEX篩選 ? 單鏈 DNA文庫的 SELEX篩選 核酸的生物信息學 1 核酸序列數(shù)據(jù)庫 ? 三大核酸序列數(shù)據(jù)庫介紹 ? 三大核酸序列數(shù)據(jù)庫基本結構 ? 核酸序列數(shù)據(jù)庫檢索方法 2 核酸序列的分析 ? Blast的使用方法 ? 核酸序列的雙重比對 一 核酸序列數(shù)據(jù)庫 核酸的生物信息學 二 核酸的二級結構預測與核酸的網(wǎng)上資源 1 核酸的二級結構預測 ? 方法簡介 ? 常用軟件及使用方法 2 核酸的網(wǎng)上資源 ? 綜合網(wǎng)站介紹 ? 不同領域相關網(wǎng)站 綜述： 1 RNAi 2 非編碼 RNA 3 合成生物學
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