信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究方法ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-12 06:26本頁(yè)面
【正文】 基因?qū)氲缴矬w基因組中，導(dǎo)入基因的表達(dá)可引起生物體性狀可遺傳的改變，稱之為轉(zhuǎn)基因。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物： 以實(shí)驗(yàn)方法將外源基因?qū)雱?dòng)物染色體基因組內(nèi)穩(wěn)定整合并能遺傳給后代的一類動(dòng)物。 轉(zhuǎn)基因技術(shù) transgenic technology 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)步驟 : ? 轉(zhuǎn)基因載體的構(gòu)建； ? 將轉(zhuǎn)基因載體導(dǎo)入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞； ? 將轉(zhuǎn)基因受精卵或胚胎干細(xì)胞植入假孕小鼠子宮內(nèi)； ? 對(duì)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物進(jìn)行鑒定。 轉(zhuǎn)基因載體 結(jié)構(gòu)基因 報(bào)告基因 增強(qiáng)子 啟動(dòng)子 受精 全能性細(xì)胞 注射 植入 假孕小鼠 后代 Southern blot RTPCR Western blot 轉(zhuǎn)基因小鼠 基因敲除技術(shù) Gene Knockout ? 體外合成無(wú)效基因或突變基因； ? 定向插入 (同源重組 )宿主細(xì)胞染色體 DNA中 取代相應(yīng)正?；?, 使特定目的基因在細(xì)胞內(nèi)或生物體內(nèi)失活； ? 應(yīng)用轉(zhuǎn)基因方法孵育出轉(zhuǎn)基因動(dòng)物 ,即為基因敲除動(dòng)物。 基因敲除技術(shù) Gene Knockout ? 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中第二信使含量的測(cè)定 第二信使含量的高低同信號(hào)傳遞密切相關(guān)。 1.[Ca2+]的測(cè)定： 原子光譜法、離子微電極測(cè)定法、放射示蹤法及標(biāo)記示蹤法等。目前常用標(biāo)記示蹤法，即用熒光探針標(biāo)記靶細(xì)胞。常用的熒光探針有 quin2/Am、 Fura2/Am及 Indo1等，后二者較為敏感。 ： 采用 3HTdR標(biāo)記的肌醇標(biāo)記靶細(xì)胞后，用不同的刺激劑刺激細(xì)胞，分離磷脂酰肌醇混合物，通過(guò)陰離子交換層析柱分離洗脫，收集 IP3洗脫峰后進(jìn)行液閃測(cè)定。此外，還可以使用 Amersham公司生產(chǎn)的 DmyoIP3[3H]分析系統(tǒng)直接測(cè)定粗提物中的 IP3含量，此方法簡(jiǎn)易、敏感。 ： 首先提取含 DAG的樣品，用 DAG激酶催化底物 DAG，使之發(fā)生磷酸化，外源加入 32γATP，最后將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行分離后測(cè)定放射性含量，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品計(jì)算出樣品中 DAG的含量。 ： （ 1） cAMP[3H]分析系統(tǒng)，其優(yōu)點(diǎn)是放射性半衰期長(zhǎng)，可用于大量樣品的分析；（ 2） cAMP[125I]分析系統(tǒng)，用于小量樣品的分析；（ 3） cAMP ELISA測(cè)定方法，此方法簡(jiǎn)便、敏感。 例如檢測(cè)組織或細(xì)胞中某個(gè)信號(hào)通路及其作用 : 1. 樣本（組織，細(xì)胞）； 2. 免疫組化，免疫細(xì)胞化學(xué)定位 3. RTPCR(Realtime PCR), Western blot 檢測(cè)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)（ mRNA水平，蛋白水平），磷酸化狀態(tài)； 4. 檢測(cè)通路相互作用蛋白（ CoIP等） 6. 關(guān)鍵信號(hào)分子基因沉默或增強(qiáng)（沉默：抑制劑 /siRNA/抗體/基因敲除動(dòng)物；增強(qiáng)：激動(dòng)劑 /構(gòu)建過(guò)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染） 7. 芯片 /組學(xué)檢測(cè) 信號(hào)通路研究基本策略 例如研究某藥物對(duì)細(xì)胞的作用及相關(guān)信號(hào)通路 : 1. 藥物刺激細(xì)胞（時(shí)間梯度，濃度梯度）； 2. 檢測(cè)藥物對(duì)細(xì)胞的作用（毒性，增殖，凋亡，侵襲，遷移等）； 3. 共聚焦顯微鏡定位； 4. RTPCR(Realtime PCR), Western blot 檢測(cè)通路關(guān)鍵信號(hào)分子的表達(dá)（ mRNA水平，蛋白水平）），磷酸化狀態(tài)； 5. 檢測(cè)通路相互作用蛋白（ CoIP， FRET等） 6. 關(guān)鍵信號(hào)分子基因沉默（抑制劑 /siRNA/抗體）后檢測(cè) 7. 芯片 /組學(xué)檢測(cè) 謝謝 信號(hào)通路研究基本策略 基因功能研究策略 新發(fā)現(xiàn)的功能未知的基因： ? 通過(guò)生物信息學(xué)分析對(duì)該基因所編碼蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)及功能進(jìn)行預(yù)測(cè) 。 ? 應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù)在細(xì)胞及動(dòng)物水平進(jìn)行研究（蛋白表達(dá)，細(xì)胞定位，沉默或過(guò)表達(dá)對(duì)細(xì)胞功能的影響等） 。 ? 通過(guò)探討與該基因蛋白相互作用的蛋白而確定新基因的功能。 ? 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域分析和結(jié)構(gòu)測(cè)定
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