【正文】 引起以細(xì)胞免疫為主的 IV型變態(tài)反應(yīng)。由于這種反應(yīng)具有高度的特異性和敏感性，因此臨床上常利用變態(tài)反應(yīng)作為某些傳染病的診斷方法。如鼻疽菌素、結(jié)核菌素、布氏菌水解素、提純副結(jié)核菌素等。 診斷抗原的制備 ? 基本技術(shù)路線包括：選擇抗原性良好的菌（毒）株 ??? 生產(chǎn)用菌（毒）種的制備與鑒定 ??? 制備細(xì)菌抗原用培養(yǎng)基或制備病毒抗原用細(xì)胞或動(dòng)物等原材料的選擇 ??? 細(xì)菌（固體或液體）的培養(yǎng)或病毒液的繁殖、收獲 ???抗原液的滅活 ??? 抗原的提純、濃縮 ??? 除菌過(guò)濾 ??? 抗原的檢驗(yàn) ??? 抗原的分裝與凍干 ??? 保存。 ? 不同的微生物制備診斷抗原的方法不同，不同的抗原制備方法也有差異。有些抗原需要較復(fù)雜的工藝，如變態(tài)反應(yīng)抗原、免疫沉淀試驗(yàn)抗原的制備往往需要提純和濃縮抗原，以增加抗原反應(yīng)的特異性和敏感性。中和試驗(yàn)抗原制備比較簡(jiǎn)單，一般不需提純與濃縮。 （二）診斷血清的制備 ? 診斷血清是一類(lèi)含有特異性抗體、用于診斷或鑒定微生物的生物制劑，包括各種診斷血清、分群血清或分型血清等。 ? 免疫動(dòng)物的選擇 制備免疫血清的動(dòng)物多為家兔、豚鼠、馬、牛、羊及雞等。免疫前，須經(jīng)確認(rèn)無(wú)傳染病并健康者方可使用。禽類(lèi)血清有抗補(bǔ)體成分，在制備補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)用抗血清時(shí)應(yīng)選用哺乳動(dòng)物。 ? 免疫抗原的制備 制備免疫血清的抗原，多為微生物體或其毒素 (類(lèi)毒素 )，或其提取物等純化完全抗原。免疫抗原的提純和濃縮，是制出高效價(jià)血清的先決條件。 免疫方法和免疫程序 ? 免疫原注射多采用皮下或肌肉途徑注射，大量抗原注射則以靜脈途徑較好，但抗毒素免疫則不采用靜脈途徑，應(yīng)以背部多點(diǎn)注射為宜。 ? 有一些用球蛋白抗原制備抗抗體血清時(shí)，須要加適當(dāng)佐劑注射，如用弗氏完全或不完全佐劑，背部皮下多點(diǎn)注射，第一次免疫加完全佐劑，以后多次免疫只能使用不完全佐劑，隔 7— 10天加強(qiáng)免疫一次，可以獲得較好的抗抗體血清。 血清采集與提取 ? 最后一次大劑量注射抗原后 8～ 10天進(jìn)行第一次采血。采血量可按動(dòng)物體重每公斤采 10ml左右。動(dòng)物采血應(yīng)在上午空腹時(shí)進(jìn)行，前一天下午不喂精料，只喂草料及水。 3～ 4天后進(jìn)行第二次采血。采血后 3— 5天再次注射大量抗原，如此循環(huán)進(jìn)行采血及注射抗原。 免疫血清的檢驗(yàn)與標(biāo)化 ? 1）免疫血清的檢驗(yàn)：診斷用血清的檢驗(yàn)主要是特異性、敏感性和效價(jià)的測(cè)定。作標(biāo)記抗體用血清，免疫球蛋白含量應(yīng)達(dá)到一定的絕對(duì)值。 ? 2 ）免疫血清的標(biāo)化：診斷用陽(yáng)性血清，特別是分群血清和分型血清等，均須標(biāo)化成為標(biāo)準(zhǔn)品或參考標(biāo)準(zhǔn)品，有些還須用國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行標(biāo)化，定出國(guó)際單位 (1U)。 標(biāo)記抗體的制備 ? 標(biāo)記抗體技術(shù)主要有熒光抗體技術(shù)、免疫酶組化染色技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、放射免疫測(cè)定、免疫膠體金技術(shù)等。 ? 豬瘟熒光抗體的制備方法 將高免血清用飽和硫酸銨鹽析法提取免疫球蛋白 G（ IgG），用 2％（ W/V）抗體蛋白液按80： 1的重量比與異硫氰酸熒光素（ FITC）在 10?C左右結(jié)合 6小時(shí)。通過(guò) SephadexG50柱層析，除去未結(jié)合的游離熒光素，測(cè)定熒光抗體染色效價(jià)和蛋白濃度，蛋白濃度不應(yīng)超過(guò) 。 四、獸用生物制品檢測(cè)技術(shù) （一）獸用生物制品檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 獸用活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)： 物理性狀：液體疫苗應(yīng)無(wú)異物、搖不散的凝塊、絮狀物、霉團(tuán)、變質(zhì)；凍干疫苗無(wú)干縮、瓶破裂、瓶口密封不嚴(yán)。 純粹檢驗(yàn)：所有制品不應(yīng)污染細(xì)菌、霉菌。病毒組織苗如有細(xì)菌污染，非病原菌每頭份不超過(guò) 1個(gè)；病毒性活疫苗不應(yīng)污染支原體和外源病毒，尤其是明確規(guī)定禽源活疫苗必須用 COFAL試驗(yàn)檢測(cè)不應(yīng)有禽白血病病毒的污染。 鑒別檢驗(yàn)：應(yīng)能被特異抗血清所中和。 獸用活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 安全檢驗(yàn)： 在專(zhuān)用動(dòng)物舍進(jìn)行，一般使用 10個(gè)頭份的疫苗進(jìn)行 ,無(wú)論是本動(dòng)物或非本動(dòng)物進(jìn)行的安全檢驗(yàn)，必須全部符合規(guī)定。規(guī)定用多種動(dòng)物進(jìn)行安全檢驗(yàn)的制品，任何一種動(dòng)物結(jié)果不符合規(guī)定者，均判不合格。 效力檢驗(yàn)： 1）病毒滴定或細(xì)菌計(jì)數(shù)：應(yīng)保證比最小免疫原性的數(shù)量大，且在規(guī)定的有效期內(nèi)均不應(yīng)低于規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)。2）動(dòng)物免疫方法：測(cè)定免疫動(dòng)物的血清抗體或免疫攻毒進(jìn)行判定。 水份測(cè)定：不應(yīng)超過(guò) 4%。 真空度測(cè)定：每瓶疫苗均應(yīng)有真空。 獸用滅活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 物理性狀：油乳劑滅活疫苗的外觀應(yīng)為乳白色均勻乳劑，單相苗 為油包水，雙相苗為水包油包水劑型； 37℃ 放置 21天 不破乳；單相苗的粘度在 10秒以內(nèi)，雙相苗的粘度在 5秒以內(nèi)。 無(wú)菌檢驗(yàn)：不應(yīng)污染細(xì)菌、霉菌；不得含有活的本菌和本毒。 安全檢驗(yàn)： 在專(zhuān)用動(dòng)物舍進(jìn)行，一般使用 2個(gè)頭份的疫苗進(jìn)行 檢驗(yàn)， 無(wú)論是本動(dòng)物或非本動(dòng)物進(jìn)行的安全檢驗(yàn)， 必須全部符合規(guī)定。 獸用滅活疫苗檢驗(yàn)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 效力檢驗(yàn)：多用本動(dòng)物進(jìn)行相關(guān)的效力試驗(yàn)（接種 /攻毒或檢測(cè)血清抗體），當(dāng)對(duì)照組攻毒成立或抗體陰性時(shí)，疫苗免疫組的保護(hù)力或抗體水平須符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。 甲醛、苯酚、硫柳汞含量測(cè)定：甲醛含量不應(yīng)超過(guò) %；苯酚含量不應(yīng)超過(guò) %；硫柳汞含量不應(yīng)超過(guò) %。 （二） 獸用生物制品質(zhì)量檢測(cè)技術(shù) 、生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 物理化學(xué)、生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用 ?物理學(xué)方法：獸用生物制品的檢驗(yàn)大量采用物理學(xué)方法，如物理性狀檢驗(yàn)、真空度測(cè)定和水分測(cè)定等。 ?化學(xué)分析方法：滅活疫苗中甲醛、硫柳汞和苯酚含量測(cè)定采用的是化學(xué)分析滴定方法。 ?生物學(xué)技術(shù)：微生物培養(yǎng)方法：如無(wú)菌檢驗(yàn)、支原體污染的檢驗(yàn)及效力檢驗(yàn)中活菌計(jì)數(shù)或病毒含量測(cè)定均采用微生物培養(yǎng)方法，細(xì)菌或支原體培養(yǎng)用適宜培養(yǎng)基進(jìn)行，病毒的培養(yǎng)用雞胚或適宜的細(xì)胞進(jìn)行；動(dòng)物接種方法：如安全檢驗(yàn)用本動(dòng)物或非本動(dòng)物接種方法進(jìn)行。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ? 血凝與血凝抑制試驗(yàn)：血凝試驗(yàn)是利用具有血凝性病毒選擇性的 凝集動(dòng)物紅細(xì)胞的特性來(lái)測(cè)定病毒的效價(jià)。主要用于 ND、細(xì)小病毒等活 疫苗的病毒含量測(cè)定及活疫苗中污染具有血凝性病毒的檢測(cè)。血凝抑制 試驗(yàn)利用病毒凝集紅細(xì)胞的特性能被相應(yīng)抗體抑制來(lái)測(cè)定相應(yīng)抗體的效 價(jià)，常用在具有血凝性病毒疫苗如產(chǎn)蛋下降綜合征、豬和犬細(xì)小病毒病 等滅活疫苗及 ND疫苗免疫動(dòng)物后血清抗體的檢測(cè)（效力檢驗(yàn)）。 ? 間接血凝和反向間接血凝試驗(yàn) ： 間接血凝是將抗原致敏紅細(xì)胞，反 向間接血凝試驗(yàn)是將抗體致敏紅細(xì)胞。 前者用于仔豬大腸菌 K8 K99雙 價(jià)基因工程滅活疫苗、豬囊蟲(chóng)病滅活疫苗的效力檢驗(yàn)或間接血凝診斷試 劑的檢驗(yàn)。后者多用于疫苗的抗原含量或相關(guān)診斷試劑的檢驗(yàn)。以膠乳 為載體的膠乳凝集試驗(yàn)用于豬偽狂犬病診斷試劑盒的檢驗(yàn)。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ? 中和試驗(yàn) ： 為常用的免疫學(xué)方法，既可定性，又可定量。既有固定血清 — 稀釋病毒（ ?法），又有固定病毒 — 稀釋血清（ ?法）。 將特異性血清與相應(yīng)疫苗病毒混合，使病毒失去感染宿主的能力（中和）。用血清 — 病毒混合物接種靶動(dòng)物、雞胚或細(xì)胞培養(yǎng)，觀察其是否感染來(lái)判斷疫苗的效力、疫苗病毒的特異性或是否污染外源病原。 ? 動(dòng)物中和試驗(yàn)：主要用于牛瘟、豬瘟疫苗、口蹄疫疫苗（乳鼠）等活疫苗的鑒別檢驗(yàn)及其檢驗(yàn)用動(dòng)物的篩選、梭菌疫苗的效力檢驗(yàn)和定型血清效價(jià)測(cè)定。 ? 雞胚中和試驗(yàn)：主要用于禽用病毒性活疫苗的特異性檢驗(yàn)和病毒性活疫苗的外源病毒檢測(cè)及疫苗的效力檢驗(yàn)。 ? 細(xì)胞中和試驗(yàn)：主要用于豬偽狂犬 、犬多聯(lián)活疫苗、雞傳染性法氏囊病活疫苗等效力檢驗(yàn)、特異性檢驗(yàn)、抗體效價(jià)測(cè)定 及外源病原 檢測(cè)。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn) ：在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)反應(yīng)系統(tǒng)中 ， 當(dāng)抗原與抗體發(fā)生特 異反應(yīng)時(shí) ， 抗原 — 抗體復(fù)合物結(jié)合一定量的補(bǔ)體 ，而指示系統(tǒng) (致敏紅細(xì)胞 ） 的溶血作用也需要補(bǔ)體的參與 。 因此在補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)中根據(jù)指示系統(tǒng)溶血程度可知反應(yīng)系統(tǒng)中抗原與抗體的關(guān)系 。 在獸用生物制品的檢驗(yàn)中 ， 補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)主要用于細(xì)菌性疾病如布魯氏菌病 、 副結(jié)核 、 衣原體病 、 鉤端螺旋體病 、 伊氏錐蟲(chóng)病 、 鼻疽等補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)抗原的檢測(cè)及馬傳貧活疫苗的抗原性檢驗(yàn) 、 禽用活疫苗及其種毒中禽白血病病毒污染的檢測(cè) 。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?對(duì)流免疫電泳：用于檢測(cè)水貂阿留申病對(duì)流免疫電泳抗原與陽(yáng)性血清的特異性 。 ?酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn) （ ELISA） ： 已知抗原或抗體與相應(yīng)的診斷抗體或抗原在酶聯(lián)板中或玻片上發(fā)生特異性結(jié)合 ， 在酶標(biāo)記抗體和酶底物的參與下 ， 呈現(xiàn)顏色反應(yīng) 。 ELISA試驗(yàn)包括直接法 、 間接法 、 雙抗體夾心法 。 用于馬傳染性貧血 、 藍(lán)舌病 、 大腸桿菌病 、 豬旋毛蟲(chóng)病 、 牛副結(jié)核 、 豬瘟等疫病的酶聯(lián)診斷試劑的特異性檢驗(yàn)和 （ 或 ） 效價(jià)測(cè)定 、馬傳貧活疫苗的效價(jià)測(cè)定 。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?斑點(diǎn)試驗(yàn) （ Dot— ELISA） ：是根據(jù)已知疫病特異性標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清能與相應(yīng)疫病的斑點(diǎn)酶聯(lián)診斷試劑于硝酸纖維膜等固相材料上發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) ， 在酶標(biāo)記單克隆抗體和酶底物的參與下 ， 呈現(xiàn)顏色反應(yīng)的原理 ， 用于日本血吸蟲(chóng)病和馬傳貧 Dot— ELISA診斷試劑的特異性 、 非特異性檢驗(yàn)和效價(jià)測(cè)定 。 ?熒光抗體染色技術(shù) ：將抗體標(biāo)記上熒光素 ， 利用抗原抗體反應(yīng)的特異性 ， 在熒光顯微鏡下觀察熒光來(lái)檢查未知抗原 。 常用于豬瘟熒光抗體的特異性檢驗(yàn) 、馬立克氏病多價(jià)活疫苗的效價(jià)測(cè)定 、 非禽源細(xì)胞（ 或細(xì)胞系 ） 及其制品的外源病毒檢驗(yàn) 。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)：用于口蹄疫病毒感染相關(guān)抗原 、馬傳貧 、 牛白血病 、 藍(lán)舌病瓊脂擴(kuò)散抗原及陽(yáng)性血清的特異性檢驗(yàn)和效價(jià)測(cè)定 。 ?其它：膠體金免疫檢測(cè)技術(shù)用在雞傳染性法氏囊病診斷試劑的檢測(cè)；生物素 — 親和素系統(tǒng)結(jié)合熒光抗體染色技術(shù)和酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)用于診斷制品中 。 分子生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ? 單克隆抗體技術(shù) 在診斷制品的檢驗(yàn)中廣泛使用 。 許多疫苗尤其是 多價(jià)疫苗如馬立克氏病多價(jià)活疫苗的病毒含量測(cè)定 （ 蝕斑計(jì)數(shù) ） 和鑒別檢驗(yàn)等也采用單克隆抗體技術(shù) （ 熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù) ） 進(jìn)行 ， 以區(qū)別不同型或亞型的病毒 。 日本血吸蟲(chóng)病 、 馬傳貧 、豬瘟等診斷制品均采用單克隆抗體技術(shù)進(jìn)行制品的特異性檢驗(yàn) 。 ? PCR擴(kuò)增技術(shù) 用于仔豬大腸菌 K8 K99雙價(jià)基因工程滅活疫苗和仔豬大腸菌 K8 LTB雙價(jià)基因工程活疫苗工程菌的鑒定 。 其它如種毒的鑒定 、 病毒性活疫苗中外源病毒污染的檢測(cè) 。 ? 核酸探針 、 核酸雜交技術(shù) 用于診斷制品的檢驗(yàn) 。 謝謝！