【正文】 酸鋁為油相，以含 2— 4%吐溫的抗原液為水相，按水相與油相 1： 1— 1： 4（ V/V）的比例配制。 ? 2） 人工傳代致弱菌株 在培養(yǎng)基中或非宿主體內(nèi)等連續(xù)傳代減弱病原的致病性，以制作活疫苗。 ? 2） 同屬異種的微生物 選擇與病原同屬不同種，但具有一定的交叉免疫原性，天然宿主不同的微生物株系作為疫苗株，如火雞皰疹病毒預(yù)防雞馬立克氏病，山羊痘細胞致弱毒株預(yù)防綿羊痘和羊接觸傳染性膿皰皮炎等。 ? 2) 雞接種檢查法 將種毒接種適宜日齡的 SPF雛雞 20只，點眼、滴鼻接種 10頭份；肌肉注射 100頭份，接種后 21日，重復(fù)接種 1次，第一次接種后 42日采血，測定相關(guān)病原的抗體。此外不應(yīng)出現(xiàn)紅細胞吸附現(xiàn)象。也可應(yīng)用馬血清、大牛血清、綿羊血清或雞、兔血清等。 疫苗保護劑 ? 1）凍干疫苗保護劑（穩(wěn)定劑） 防止疫苗在凍干過程中活性物質(zhì)失去結(jié)構(gòu)水及阻止結(jié)構(gòu)水形成結(jié)晶；保護微生物中活性物質(zhì)的活性與抗原性；降低細胞內(nèi)外的滲透壓差；保持弱毒疫苗中微生物在干燥狀態(tài)下的活力和復(fù)蘇時迅速恢復(fù)活力；對疫苗的免疫效果無影響；對微生物的保護性能（尤其是耐熱性能）良好；凍干產(chǎn)品的物理性狀（外觀、色澤、溶解性等）符合要求。 ? 4）新型生物發(fā)酵技術(shù) 傳統(tǒng)的生物發(fā)酵罐變?yōu)樯锓磻?yīng)器，實現(xiàn)了程序化操作。直接凝集試驗只適用于不產(chǎn)生自凝現(xiàn)象的細菌，所以應(yīng)用面較窄。 如果檢驗系統(tǒng)中抗原與抗體形成復(fù)合物，則補體被結(jié)合不再游離，隨后加入的指示系統(tǒng)不發(fā)生溶血現(xiàn)象。由于這種反應(yīng)具有高度的特異性和敏感性，因此臨床上常利用變態(tài)反應(yīng)作為某些傳染病的診斷方法。免疫前，須經(jīng)確認無傳染病并健康者方可使用。動物采血應(yīng)在上午空腹時進行，前一天下午不喂精料，只喂草料及水。通過 SephadexG50柱層析，除去未結(jié)合的游離熒光素，測定熒光抗體染色效價和蛋白濃度，蛋白濃度不應(yīng)超過 。2）動物免疫方法：測定免疫動物的血清抗體或免疫攻毒進行判定。 （二） 獸用生物制品質(zhì)量檢測技術(shù) 、生物學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 物理化學(xué)、生物學(xué)技術(shù)應(yīng)用 ?物理學(xué)方法：獸用生物制品的檢驗大量采用物理學(xué)方法，如物理性狀檢驗、真空度測定和水分測定等。后者多用于疫苗的抗原含量或相關(guān)診斷試劑的檢驗。 ? 細胞中和試驗：主要用于豬偽狂犬 、犬多聯(lián)活疫苗、雞傳染性法氏囊病活疫苗等效力檢驗、特異性檢驗、抗體效價測定 及外源病原 檢測。 2. 免疫 — 血清學(xué)技術(shù)的應(yīng)用 ?斑點試驗 （ Dot— ELISA） ：是根據(jù)已知疫病特異性標(biāo)準(zhǔn)陽性血清能與相應(yīng)疫病的斑點酶聯(lián)診斷試劑于硝酸纖維膜等固相材料上發(fā)生特異性結(jié)合反應(yīng) ， 在酶標(biāo)記單克隆抗體和酶底物的參與下 ， 呈現(xiàn)顏色反應(yīng)的原理 ， 用于日本血吸蟲病和馬傳貧 Dot— ELISA診斷試劑的特異性 、 非特異性檢驗和效價測定 。 ? PCR擴增技術(shù) 用于仔豬大腸菌 K8 K99雙價基因工程滅活疫苗和仔豬大腸菌 K8 LTB雙價基因工程活疫苗工程菌的鑒定 。 許多疫苗尤其是 多價疫苗如馬立克氏病多價活疫苗的病毒含量測定 （ 蝕斑計數(shù) ） 和鑒別檢驗等也采用單克隆抗體技術(shù) （ 熒光抗體染色技術(shù)或酶聯(lián)免疫染色技術(shù) ） 進行 ， 以區(qū)別不同型或亞型的病毒 。 ELISA試驗包括直接法 、 間接法 、 雙抗體夾心法 。 ? 動物中和試驗：主要用于牛瘟、豬瘟疫苗、口蹄疫疫苗（乳鼠）等活疫苗的鑒別檢驗及其檢驗用動物的篩選、梭菌疫苗的效力檢驗和定型血清效價測定。 ? 間接血凝和反向間接血凝試驗 ： 間接血凝是將抗原致敏紅細胞，反 向間接血凝試驗是將抗體致敏紅細胞。 獸用滅活疫苗檢驗技術(shù)標(biāo)準(zhǔn) 效力檢驗：多用本動物進行相關(guān)的效力試驗（接種 /攻毒或檢測血清抗體），當(dāng)對照組攻毒成立或抗體陰性時，疫苗免疫組的保護力或抗體水平須符合標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。規(guī)定用多種動物進行安全檢驗的制品，任何一種動物結(jié)果不符合規(guī)定者，均判不合格。 標(biāo)記抗體的制備 ? 標(biāo)記抗體技術(shù)主要有熒光抗體技術(shù)、免疫酶組化染色技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗、放射免疫測定、免疫膠體金技術(shù)等。 血清采集與提取 ? 最后一次大劑量注射抗原后 8～ 10天進行第一次采血。 （二）診斷血清的制備 ? 診斷血清是一類含有特異性抗體、用于診斷或鑒定微生物的生物制劑，包括各種診斷血清、分群血清或分型血清等。 ? 5）免疫沉淀試驗抗原 當(dāng)可溶性抗原與其相應(yīng)的抗體在溶液中或瓊脂凝膠中擴散接觸時，形成的抗原－抗體復(fù)合物成為肉眼可見的不溶性沉淀物，即為免疫沉淀反應(yīng)。指示系統(tǒng)包括綿羊紅細胞、溶血素和補體。參與凝集反應(yīng)的抗原為凝集原，抗體為凝集素。 ? 2）抗原緩釋技術(shù) 將抗原制成聚合物，增加抗原效能、延長疫苗免疫期。 ? 2）凍干苗的配制 按疫苗原液量加入一定比例的保護（穩(wěn)定）劑，病毒性組織苗需預(yù)先制成乳劑后，加入一定比例的保護（穩(wěn)定）劑，充分混合后，按規(guī)定頭份定量分裝，分裝過程中應(yīng)隨時振搖，分裝結(jié)束后迅速進行冷凍真空干燥。對達不到標(biāo)準(zhǔn)要求的，將根據(jù)《 獸藥管理條例 》 規(guī)定進行處理。 ? 2) 綠猴腎 (vero)傳代細胞檢查法 將中和后的接種 vero細胞，連傳 2代，不應(yīng)出現(xiàn) CPE，同時進行紅細胞（豚鼠、雞和人紅細胞混合物）吸附試驗和熒光抗體試驗，均應(yīng)為陰性。 、菌（毒）種的鑒定 ? 2） 毒力返強試驗 用基礎(chǔ)菌（毒）種較早代次，按實際接種途徑大劑量接種各種最易感日齡的靶動物，一定時間后，采集含菌（毒）靶組織制成懸液，再接種另一組易感的靶動物，如此至少傳 5代次，觀察每次傳代動物的反應(yīng)情況，并比較第一代和最后一代動物的反應(yīng)和毒力或致病性增強的趨勢情況。 、毒種的選育 1） 自然弱毒株 選用自然界中具有免疫原性的天然弱毒株，可以用于生產(chǎn)動物用活疫苗。 菌（毒）種的選育 ? 、 菌種的選育 ? 1） 自然弱毒菌株 自然界中存在著具有免疫原性的自然弱毒株，可以用于生產(chǎn)活疫苗。 制苗工藝 1）用鋁膠作佐劑 配苗時，將滅活的菌液和氫氧化鋁膠以一定的比例（ 3： 1— 9： 1）混合，再加入適量的硫柳汞和苯酚充分振蕩而成。 、佐劑的類型 ? 5）微生物及其代謝產(chǎn)物佐劑 為細菌的菌體成分，具有明顯的佐劑作用。 ? 《 規(guī)程 》 中明確規(guī)定了注射白油（輕質(zhì)礦物油）的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，要求其性狀（相對密度、粘度）、酸度、重金屬、鉛、砷、稠環(huán)芳烴、固形石蠟及易碳化物等項檢驗均應(yīng)符合規(guī)定。 、佐劑作用 ? 對機體的作用 引起巨噬細胞、淋巴細胞及漿細胞等細胞浸潤，促進其繁殖，增強其活性；加速淋巴細胞的轉(zhuǎn)化成效應(yīng)細胞；增加細胞膜的活性和胞漿變化，分泌輔助性因子；改變細胞功能，巨噬細胞表現(xiàn)為數(shù)量增多、膜表面積增大、產(chǎn)生大量輔助因子和前列腺素等調(diào)節(jié)因子， T細胞和 B細胞表現(xiàn)為數(shù)目增多、進入細胞增殖周期，膜表面成分發(fā)生改變，產(chǎn)生大量輔助因子（ LK）， B細胞則分化為漿細胞，分泌大量的抗體。 、滅活方法 ? 1）物理滅活方法 有熱滅活、射線照射滅活和超聲波裂解等方法。吸入空氣中的水分子時緩緩分解成羥基丙酸，其水溶液迅速全部分解，密封保存在玻璃瓶中于 4－ 8?C保存較穩(wěn)定。細胞培養(yǎng)用生物反應(yīng)器可連續(xù)進行培養(yǎng)，隨時采樣觀察，生產(chǎn)效率提高 200％～ 300％，大大降低產(chǎn)品的成本；有完善的由計算機控制的檢測及培養(yǎng)系統(tǒng)，保證了運行的安全；體積小，減少了生產(chǎn)車間所需的凈化空間面積；自動化程度高，大大降低了污染率。培養(yǎng)基與佐劑（氫氧化鋁膠、油佐劑等）均可在缸內(nèi)消毒，在缸內(nèi)進行細菌的培養(yǎng)及滅活、加佐劑配苗與分裝等，可大量生產(chǎn)出質(zhì)量較好的菌苗。雞翅下肱靜脈注射時，側(cè)臥固定，張開翅膀，拔去注射部位的羽毛，碘酊消毒，用針頭斜面朝上刺入靜脈注射 1－5ml接種物。綿羊腦內(nèi)接種時，先固定在接種臺上，剪去頭頂部的毛，并用硫化鋇脫毛，碘酊消毒后，在顱頂部中線左或右側(cè)，用錐鉆一小孔，硬腦膜下或腦內(nèi)接種 1ml，立即用火棉膠封閉接種孔。用長約 4號針頭插入血管內(nèi)注射接種物 。沿受精卵長徑平行方向刺入針頭約 1cm，注入接種物 －，用石蠟封孔，繼續(xù)孵化。 細胞培養(yǎng)方法 ? 3）懸浮培養(yǎng) 在懸浮培養(yǎng)罐中通過不斷攪拌，并隨時補充營養(yǎng)液和校正 pH值，使細胞在懸浮的條件下培養(yǎng)生長。適宜于許多動物病毒的生長，易于培養(yǎng)，可以建立種子庫，質(zhì)量易控制。 細胞培養(yǎng)技術(shù) 細胞培養(yǎng)類型 （ 1）原代細胞 原代細胞是用動物新鮮組織如胚胎或幼畜的組織或受精卵，經(jīng)胰蛋白酶消化分散后制備而成。 ? 3) 氨基酸 細胞培養(yǎng)所用的氨基酸為左旋異構(gòu)體。 ? 在沒有條件的實驗室，簡便的做法是用有蓋玻璃容器，放入接種的培養(yǎng)物后，點燃蠟燭，加蓋密閉容器，由于燃燒耗氧產(chǎn)生二氧化碳，蠟燭即熄滅。 ? 抑菌分離培養(yǎng) 利用某些化學(xué)藥品對某類細菌的抑制或殺滅作用，而對另一些細菌不生產(chǎn)明顯的作用，來分離培養(yǎng)某些細菌。 ? 索?。喉毘钟邢鄳?yīng)級別機構(gòu)出具的正式公函，說明菌種名稱、型別、數(shù)量及用途。 ? 毒種的選育 弱毒毒種有天然弱毒株或人工致弱毒株；強毒毒株分離 → 系統(tǒng)鑒定（無污染、毒力強而穩(wěn)定、免疫原性好、抗原譜廣、與流行毒血清型相符） → 疫苗候選株。 菌（毒）種 ? 、 菌（毒）種 標(biāo)準(zhǔn) ? 歷史清楚； ? 生物學(xué)性狀明顯； ? 遺傳穩(wěn)定； ? 優(yōu)良的免疫原性與反應(yīng)原性； ? 毒力在規(guī)定的范圍內(nèi)。 ? 基于核酸序列擴增技術(shù)（ NASBA）。 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) ? （ 5）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ ELISA）：包括直接法、間接法、雙抗體夾心、競爭 ELISA等?？梢酝瑫r表達多種抗原，制成多價或多聯(lián)疫苗，毒力不返強。但可能存在不安全風(fēng)險。 2)滅活的毒素或提取的亞單位或 rDNA產(chǎn)生亞單位。 按照性質(zhì)和制造方法 疫（菌）苗、類毒素、抗血清、診斷制劑和微生態(tài)制劑等。 活疫苗 (弱毒疫苗 ) 1）致弱的弱毒（菌、蟲）株 動物、組織、細胞、雞胚或培養(yǎng)基 → 培養(yǎng) → 降低毒力、保留免疫原性 → 篩選。 合成肽疫苗 ? 用化學(xué)方法人工合成多肽作為抗原。 （二）診斷用制品 ? 常規(guī)免疫 — 血清學(xué)診斷技術(shù) （ 1）凝集試驗抗原： 直接凝集試驗（平板法、試管法）：抗原和抗體混合后直接發(fā)生凝集反應(yīng)。 ? （ 8）免疫組化診斷試劑。 ? 微生態(tài)制劑：含活菌的制劑，具有調(diào)節(jié)機體菌群、增強免疫力、促生長等。 ? 基礎(chǔ)種子 基礎(chǔ)種子由原種制備而來，基礎(chǔ)種子為企業(yè)生產(chǎn)獸用生物制品提供種子來源，應(yīng)作系統(tǒng)鑒定，并規(guī)定代次。 ? 液氮保存 有些細胞結(jié)合毒須在－ 196?C的液氮中保存。 ? 要求：其他任何