分子克隆載體ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-05-06 08:12本頁(yè)面
【正文】 ,重組區(qū) att（ attachment）、 int（ intagrate）及 xis（ excission）， 調(diào)控區(qū) 啟動(dòng)子、終止子和 N、 CI基因， OR 為 裂解區(qū) . λ 噬菌體及其組件的應(yīng)用 λ 噬菌體可以 容納較大的目的基因 。例如用置換法可去掉長(zhǎng)達(dá) 20kb的 λDNA ，換入相應(yīng)長(zhǎng)度的目的基因。 基因文庫(kù)構(gòu)建 常使用 λ載體； 不少先進(jìn)的質(zhì)粒應(yīng)用 λ組件 進(jìn)行構(gòu)建。 λ 噬菌體從溶原轉(zhuǎn)為裂解是一種 可誘導(dǎo)過(guò)程 。 誘導(dǎo)的因素可能很多 ， 實(shí)驗(yàn)室常用的是熱誘導(dǎo) : 分離得到某些 λ 噬菌體 ， 在低溫時(shí) （ 30℃ ） 建立溶原 ，用高溫 （ 420C） 則出現(xiàn)裂解 。 這些 λ 噬菌體的 cl基因是溫度敏感突變型的 ， 稱為 c1ts。 λcl ts1857， 可作為組件插入質(zhì)粒 DNA內(nèi) 。 目的基因插在 λcl ts857下游 ， 重組體的目的基因在 42℃ 表達(dá) ， 30℃ 不表達(dá) 。 這種方法稱為 熱誘導(dǎo)表達(dá) ， 使用的是 溫敏開(kāi)關(guān) 。 λCI ts857 ori 目的基因 PL 阻遏蛋白 30℃ 下培養(yǎng)： 目的基因 阻遏蛋白 42℃ 下培養(yǎng)： 失活 λP L和 λP R λP L和 PR 是 λ 噬菌體上 2個(gè)主要的啟動(dòng)子，都是啟動(dòng)能力相當(dāng)強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄構(gòu)件。把 λ 啟動(dòng)子連同其附屬成分，置換了 pBR322的 tetr基因，成為以 λ 啟動(dòng)子為組件的質(zhì)粒。 （ 1）粘粒（ cosmid） 能容納 大片段 （ 45kb）的小分子（ 4kb～ 6kb）載體。 組成：質(zhì)粒復(fù)制原點(diǎn)，抗藥基因，多克隆位點(diǎn)，已連接入的 λcos 位點(diǎn)。 構(gòu)建基因文庫(kù)的 λ載體 （ 2） λDNA 的體外包裝 是提高 λ 噬菌體 轉(zhuǎn)染效率 的有效方法 在 A蛋白 （有終止復(fù)制功能）， E蛋白 （是包裝蛋白）， D蛋白 （是插入蛋白）共同作用下使重組體 DNA轉(zhuǎn)入頭部。 組成特點(diǎn) : 強(qiáng)啟動(dòng)子 , 保證正確閱讀 AUG的序列 ATGNATGNATG， rrnB抗終止序列， 多位點(diǎn)接頭。 pBV系列質(zhì)粒 pBV221分子量小，易轉(zhuǎn)化， 含有 串聯(lián) 的來(lái)自 λ 噬菌體的 強(qiáng)啟動(dòng) PL及 PR，啟動(dòng)子的串聯(lián)可能有相互增強(qiáng)作用。 含有 λCI ts857組件 ，此組件可 變溫誘導(dǎo) 目的基因的表達(dá)。這一組件的存在，還可適當(dāng)?shù)匾种扑拗骶牡鞍酌富钚裕_(dá)到提高表達(dá)量的目的。 帶有真核生物基因表達(dá)組件的質(zhì)粒 真核生物與原核生物催化轉(zhuǎn)錄、翻譯及其后修飾的酶和起始復(fù)合物的結(jié)構(gòu)不同，醫(yī)學(xué)研究需要能表達(dá)真核生物基因的表達(dá)載體。 由于病毒對(duì)宿主細(xì)胞有依賴性和可整合性，真核表達(dá)組件不少來(lái)自 病毒 。如巨細(xì)胞病毒（ CMV）啟動(dòng)子，猿猴病毒 SV40的組件等。 酵母是單細(xì)胞真核生物，可接受質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。 酵母質(zhì)粒有 Yip（ integrate）整合型， Yep（ episome）附加體型， Yrp（ replication）復(fù)制型。 pYEJ001 一種以 pBR322為基礎(chǔ)的酵母質(zhì)粒，兩個(gè)抗藥基因及左下方的半圓來(lái)自 pBR322，右上半圓來(lái)自酵母，包括啟動(dòng)子、糖代謝酶類及氯霉素抗性基因，可在大腸桿菌體系重組再轉(zhuǎn)化酵母細(xì)胞 稱為 穿梭質(zhì)粒（ shuttle plasmid） 昆蟲(chóng)桿狀病毒 （ baculovirus） 如核型多角體病毒 ACNPV ，昆蟲(chóng)體系的優(yōu)點(diǎn)是表達(dá)效率高 ，目的基因插入的 容量相對(duì)大 ，使用安全等 。 目前在農(nóng)業(yè)基因工程上應(yīng)用較多。如攜帶殺蟲(chóng)基因的病毒對(duì)農(nóng)作物進(jìn)行生物防治。 YAC酵母人工染色體 把酵母染色體與基因復(fù)制和表達(dá)有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能。 pYAC只以單抄本方式繁殖，所以不適用于以生產(chǎn)為目的的基因工程。 主要用于 人類基因組研究 和 巨大基因 如 DMD基因達(dá) Mbp（ 106bp）數(shù)量級(jí)基因的克隆。
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