分子生物學載體ppt課件-資料下載頁
2025-05-03 18:09本頁面
【正文】 抗藥性基因抗藥性基因 幾個限制性酶的單一位點幾個限制性酶的單一位點裝載范圍為 31 45kb 多用于基因文庫構(gòu)建cos:cohesiveend site特點：考斯質(zhì)粒的構(gòu)建? 由于 λDNA包裝蛋白只識別粘性末端的一小段順序 cos區(qū)。將這段 DNA與質(zhì)粒連在一起，構(gòu)建的重組質(zhì)粒，可裝載外源 DNA（ )，它仍可象 λDNA一樣，在體外被包裝成有感染活性的噬菌體，進入細胞后，要通過質(zhì)粒上的復(fù)制子進行復(fù)制。cosmid vector的特點的特點 ①① 具有具有 ?噬菌體的特性噬菌體的特性 在寄主細胞內(nèi)形成環(huán)化在寄主細胞內(nèi)形成環(huán)化 DNA 不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌不能形成新的噬菌體顆粒而溶菌 克隆后可以體外包裝成噬菌體顆粒?？寺『罂梢泽w外包裝成噬菌體顆粒。②② 具有質(zhì)粒載體的特性具有質(zhì)粒載體的特性 能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。能象質(zhì)粒一樣復(fù)制。③③ 方便的選擇方便的選擇 有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。有抗菌素抗性基因，和插入失活的克隆位點。④④ 高容量的克隆能力高容量的克隆能力 45kb （最少不能低于（最少不能低于 30kb）。）。 51kb5kb=45kb? 人類和哺乳動物的基因組很大，甚至許多單個基因也相當大（如： DMD gene 2300kb） ，克隆分析就需要更大的基因載體。如近年來構(gòu)建的一些載體： BAC，PI， YAC等。4 人造染色體載體? 將細菌接合因子或酵母菌染色體上的復(fù)制區(qū)、分配區(qū)、穩(wěn)定區(qū)與質(zhì)粒組裝在一起，即可構(gòu)成染色體載體。當大片段的外源DNA克隆在這些染色體載體上后，便形成重組人造染色體，它能像天然染色體那樣，在受體細胞中穩(wěn)定的復(fù)制并遺傳。? 目前常用的人造染色體載體包括： 細菌人造染色體（ BAC） 酵母人造染色體（ YAC）人造染色體載體? 優(yōu)點：能攜帶大片段 DNA，約 300kb。 在每個細胞中，一個載體分子能繁殖多個拷貝，高產(chǎn) DNA。? 缺點：會出現(xiàn)插入片段在結(jié)構(gòu)上的不穩(wěn)定，導(dǎo)致克隆 DNA部分的缺失或重排。為克服上述缺點，人們采用低拷貝數(shù)復(fù)制子載體，如， E coli中的 F因子。此質(zhì)粒含有2種基因（ part A, part B）。 每個 E coli能接受 300kbDNA片段。細菌人造染色體（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）細菌人造染色體（ Bacterial Artificial Chromosomes BAC）? 細菌人造染色體通常是在大腸桿菌性因子FF質(zhì)粒的基礎(chǔ)上構(gòu)建的，其裝載量范圍在50 300 kb之間? 各種類型的 pBACs在大腸桿菌受體菌只能維持單一拷貝? pBACs主要適用于： 克隆大型基因簇（ gene cluster）結(jié)構(gòu) 構(gòu)建動植物基因文庫酵母人造染色體（ Yeast Artificial Chromosomes YAC）YAC載體應(yīng)含有下列元件 ：?酵母染色體的端粒序列?酵母染色體的復(fù)制子?酵母染色體的中心粒序列?酵母系統(tǒng)的選擇標記?大腸桿菌的復(fù)制子?大腸桿菌的選擇標記?YAC載體的裝載量為 350 400 kb酵母人工染色體（ YAC）? 適用于克隆大片段 DNA， ～ 2MbYAC 的主要功能成份有三： ? 1） 著絲粒 ： mitosis姊妹染色單體和 減 I同源染色體分離之必需 。? 2） 端粒： 保護染色體末端免受核酸酶的侵襲。? 3） 自主復(fù)制序列（ ARS） 元件 ：是染色體自主復(fù)制的復(fù)制起點。? 構(gòu)建 YAC需要 4個短序列： 2個端粒，著絲粒， ARS元件，與外源 DNA連接成線性 DNA分子，導(dǎo)入酵母細胞克隆。 YAC酵母人工染色體酵母人工染色體 把酵母染色體與基因復(fù)制和表達有關(guān)的主要把酵母染色體與基因復(fù)制和表達有關(guān)的主要組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母的轉(zhuǎn)錄組件都組裝在質(zhì)粒上，令質(zhì)粒行使酵母的轉(zhuǎn)錄功能和復(fù)制功能。功能和復(fù)制功能。 pYAC只以單抄本方式繁殖，所以不適用于以只以單抄本方式繁殖，所以不適用于以生產(chǎn)為目的的基因工程。生產(chǎn)為目的的基因工程。 主要用于主要用于 人類基因組人類基因組研究研究 和和 巨大基因巨大基因 如如 DMD基因達基因達 Mbp（（ 106bp）） 數(shù)量數(shù)量級基因的克隆。級基因的克隆。噬菌體 PI載體和 PAC ? PI噬菌體與 λ 噬菌體一樣，外有蛋白質(zhì)殼。內(nèi)含相當大的（ 110～ 115kb）線性 DNA， 并在體外包裝于 PI殼內(nèi)。 PI進入宿主細胞后環(huán)化，擴增。? 1994年，有人將 PI和 F因子克隆結(jié)合產(chǎn)生 PI人工染色體克隆系統(tǒng) PAC。表達載體 (expressing vector)? 特點：帶表達構(gòu)件 — 轉(zhuǎn)錄和翻譯所需的 DNA序列? 大腸桿菌表達載體：含啟動子 — 核糖體結(jié)合位點 — 克隆位點 — 轉(zhuǎn)錄終止信號– 啟動子： trplac(tac)啟動子、 λ噬菌體 PL啟動子、 T7噬菌體啟動子– 核糖體結(jié)合位點 (ribosomebinding site,RBS)： 起始密碼子 (ATG)和 SD序列– 轉(zhuǎn)錄終止序列哺乳動物表達載體? 真核表達元件：啟動子 /增強子 — 克隆位點— 終止信號和加 poly(A)信
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1