【正文】 處理后 ， 發(fā)現(xiàn)產(chǎn)量明顯下降 ， 主要就是出于控制抗生素合成的質(zhì)粒脫落造成的 。 （三）移碼誘變劑 溴化乙啶（ EB） （ 1） 吖啶化合物 的誘變機(jī)制 DNA雙鏈上的兩個(gè)堿基之間插入吖啶類(lèi)化合物分子 ， 使DNA鏈拉長(zhǎng) ， 兩堿基間距離拉寬 。 由于這類(lèi)化合物與 DNA結(jié)合后 ， 使堿基插入或缺失 ， 在 DNA復(fù)制時(shí)造成點(diǎn)突變以后的所有堿基都往后或往前移動(dòng) ， 引起全體三聯(lián)密碼轉(zhuǎn)錄 、 翻譯錯(cuò)誤而突變 ， 故稱(chēng)這種突變?yōu)橐拼a突變 。 吖啶類(lèi)化合物的誘變機(jī)制 （ 2） 吖啶黃 的性質(zhì)和使用方法 吖啶黃是淡黃色晶體 ， 微溶于熱水 ， 溶于乙醇和乙醚 ， 不穩(wěn)定 ， 遇光易分解 ， 須避光保存 。 吖啶黃使用時(shí) ， 先用少許乙醇溶解 ， 配成一定濃度的母液 。通常處理方法是將它們加入培養(yǎng)基中 ， 使最后濃度為 1050ug/mL， 混合后制成平板 ， 將處理菌懸液分離其上 ， 適溫培養(yǎng) ， 在生長(zhǎng)過(guò)程中處理 。 另外 ， 還可將吖啶黃加入到培養(yǎng)液中 ， 濃度為 1020ug/mL， 在適溫條件下 ， 振蕩培養(yǎng)過(guò)程中處理 。 羥胺的分子式為 NH2OH(簡(jiǎn)稱(chēng) HA)， 常以鹽酸羥胺形式存在(分子式為 NH2OHHCl)， 為白色晶體 ， 溶于水 ， 不穩(wěn)定易分解 ，具腐蝕性 ， 容易吸濕 ， 放要密封 、 干燥保存 。 羥化劑 ——羥胺 (四 ) 其它化學(xué)誘變劑 （ 1） 羥胺的誘變機(jī)制 羥胺是具有特異誘變效應(yīng)的誘變劑 ， 專(zhuān)一地誘發(fā) G： C→A ： T的轉(zhuǎn)換 。 對(duì)噬菌體 、 離體 DNA專(zhuān)一性更強(qiáng) 。 DNA分子上和羥胺發(fā)生反應(yīng)的堿基主要是 羥化胞嘧啶上的氨基 。 當(dāng)羥胺濃度為 ， ， 它專(zhuān)一地與胞嘧啶起反應(yīng) ， 而羥化后的胞嘧啶與腺嘌呤配對(duì) ， 引起 G： C→A ： T轉(zhuǎn)換 。 當(dāng)羥胺濃度為 ， 時(shí) ， 主要與尿嘧啶反應(yīng)；在低濃度 ， 如 103mol/L， ， 羥胺可以與胸腺嘧啶 、 鳥(niǎo)嘌呤和尿嘧啶起反應(yīng) 。 但據(jù)分析 ， 羥胺與 T、 G反應(yīng)的是它的產(chǎn)物 ， 而不是它本身 。 此外 ， 羥胺有時(shí)還能和細(xì)胞中其他物質(zhì)作用產(chǎn)生過(guò)氧化氫 ， 也具有誘變作用 。 根據(jù)誘變機(jī)制 ， 羥胺不能使突變回復(fù) ， 即不能使 A： T→G ： C轉(zhuǎn)換 ， 進(jìn)行逆向突變 。 由于羥胺是誘發(fā) G： C→A ： T的專(zhuān)一性誘變劑 ， 因此 ， 可以用來(lái)鑒別突變體是 A： T→G ： C還是 G： C→A ： T轉(zhuǎn)換 。 如果用羥胺處理突變體后 ， 產(chǎn)生回復(fù)突變體 ， 說(shuō)明原來(lái)突變是由 A：T→G ： C轉(zhuǎn)換；如果羥胺誘發(fā)突變體的結(jié)果不產(chǎn)生回復(fù)突變體 ， 說(shuō)明原突變的堿基足由 G： C→A ： T的轉(zhuǎn)換 。 這 種鑒別常用于堿基類(lèi)似物和亞硝酸等誘變劑誘發(fā)回復(fù)突變體的堿基轉(zhuǎn)換 。 （ 2） 羥胺的處理方法 常用濃度為 %5%， 可直接在溶液中處理 ， 時(shí)間 12h， 然后分離培養(yǎng) 。 但一般都加到瓊脂平板或振蕩培養(yǎng)基中 ， 然后接入孢子或細(xì)菌 ， 在適溫下培養(yǎng) ， 生長(zhǎng)過(guò)程中處理 ， 所用濃度比直接處理時(shí)低些 。 當(dāng)用亞硝酸處理引起 堿基脫氨基作用 ， 由 A變成 H時(shí) ， 第一次 DNA復(fù)制后次黃嘌呤不與胸腺嘧啶配對(duì) ， 而與胞嘧啶配對(duì) ，第二次復(fù)制后 A： T轉(zhuǎn)換為 G： C；由 C變成 U時(shí) ， 第一次 DNA復(fù)制尿嘧啶不與鳥(niǎo)嘌呤而與腺嘧啶互配 ， 第二次復(fù)制后 G： C轉(zhuǎn)換為 A： T；當(dāng) G變成 X時(shí) ， 與以上兩種倩況不同 ， 黃嘌呤仍然和胞嘧啶配對(duì) 。 從以上誘變機(jī)制中可以看出 ， 亞硝酸處理微生物時(shí) ， 可使腺嘌呤和胞嘧啶脫氨基后引起堿基 A： T→G ：C和 G： C→A ： T， 因此 ， 亞硝酸的誘變也可以發(fā)生回復(fù)突變 。 亞硝酸除了脫氨基作用外 ， 還可 引起 DNA兩條單鏈之間的交聯(lián)作用 ， 阻礙雙鏈分開(kāi) ， 影響 DNA復(fù)制 ， 從而導(dǎo)致突變 。 2 脫氨劑 —— 亞硝酸 亞硝酸脫氨基作用引起誘變的機(jī)制 亞硝酸誘變處理方法 (以處理濃度 ) 孢子的處理 ：取 孢子 懸液 1mL， 2mL及， 最后處理濃度為 。 于2526℃ 保溫 1020min， 加人 、 溶液 20mL， 使 pH下降至 ， 以終止反應(yīng) 。 稀釋分離于平板 。 細(xì)菌的處理 ：如果是 處理細(xì)菌 ， 亞硝酸最后濃度以：將斜面新鮮菌體移入肉湯培養(yǎng)摹 ， 適溫培養(yǎng)到對(duì)數(shù)期 ， 將培養(yǎng)液進(jìn)行離心 ， 棄去上清液 ， 用生理鹽水洗滌 。 ： 1濃度加入沉淀的菌體中 ， 使之懸浮 。 于 3537℃ 處理 510min、 加入 5倍的 ， 使 pH下降到 。 取一定量進(jìn)行后培養(yǎng) 。 然后稀釋分離于平板上 。 在亞硝酸處理菌體或孢子時(shí)要 嚴(yán)格控制好溫度 ， 否則會(huì)影響誘變效果 。 用于誘變育種的金屬鹽類(lèi)主要有 氯化鋰 、 硫酸錳 等 。 其中氯化鋰比較常用 ， 與其他誘變劑復(fù)合處理 ， 效果相當(dāng)顯著 。 氯化鋰是白色粉末 ， 易溶于水 ， 暴露空氣中易潮解 ， 使用時(shí)通常加到培養(yǎng)基中 。 為了避免受破壞 ， 倒平板時(shí) ， 當(dāng)培養(yǎng)基溫度 冷卻到 5060℃ 時(shí)才加入 制成平板 ， 然后把細(xì)菌或孢子涂布分離 ， 處理終濃度為 %%。 金屬鹽類(lèi) 氯化鋰單獨(dú)使用沒(méi)有明顯的誘變效果 ， 幾乎都要與共他誘變劑配合處理 ， 因此有時(shí)也稱(chēng)之為 助誘變劑 。 它在高產(chǎn)菌種選育史上發(fā)揮了極其顯著的作用 。 如選育灰黃霉素的產(chǎn)生菌用紫外線照射后分離于含氯化鋰的瓊脂平板上 ， 經(jīng)培養(yǎng)過(guò)程中處理 ， 其誘變效呆相當(dāng)顯著 。 其處理濃度隨著誘變代數(shù)增加而提高 ， 在連續(xù) 13代的誘變中 ， 氯化鋰的濃度由 %逐步提高到 %；而變異的灰黃霉素產(chǎn)量也不斷提高 ， 結(jié)合培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件的改進(jìn) ， 其發(fā)酵水平提高了 140多倍 。 另外 ， 氯化鋰和紫外線的復(fù)合處理在土霉素和麥角霉素的高產(chǎn)菌株選育中也取得顯著效果 。 助變劑（ utage） 抗變劑 (antimutagen) 色氨酸 氯化鈷和含硫化合物是 NTG的抗變劑 4 秋水仙堿 秋水仙堿是 誘發(fā)細(xì)胞染色體多倍體 的誘變劑 。 最先用于植物細(xì)胞的誘變 ， 后來(lái)作為微生物誘變處理的輔助劑 。 秋水仙堿的主要作用是 破壞細(xì)胞有絲分裂過(guò)程中紡錘絲的形 成 。 在細(xì)胞分裂過(guò)程中 ， 當(dāng)染色體已復(fù)制成兩套時(shí) ， 此時(shí)由于秋水仙堿的作用 ， 阻礙了紡錘休的形成 ， 使之具備兩套染色體的母細(xì)胞難以形成兩個(gè)子細(xì)胞 ， 從而使細(xì)胞核內(nèi)的兩套染色體都包含在一個(gè)細(xì)胞內(nèi) ， 導(dǎo)致多倍體的產(chǎn)生 。 由子多倍體細(xì)胞不穩(wěn)定 ， 在以后分裂過(guò)程中仍然要分離 。 因此 ， 這時(shí)期如進(jìn)一步使用其他較強(qiáng)的誘變劑處理菌體細(xì)胞 ， 就容易獲得突變體 。 秋水仙堿的處理方法 ： 秋水仙堿為白色粉末 ， 溶于水 ， 用時(shí)先配成濃度 %%的母液 。 孢子或細(xì)菌進(jìn)行前培養(yǎng)后 ， 加入秋水仙堿溶液 ，使最后處理濃度為 500ug/mL， 繼續(xù)培養(yǎng)一定時(shí)間 (細(xì)胞分裂 1次以上所需時(shí)間 )， 然后將培養(yǎng)液分離于平皿上；或?qū)⑴囵B(yǎng)液離心 、 洗滌 ， 再用其他誘變劑復(fù)合處理 ， 效果更好；還可以把秋水仙堿和其他誘變劑同時(shí)加到瓊脂培養(yǎng)基中制成平板 ，然后將孢子或細(xì)菌分離在乎板上 ， 進(jìn)行生長(zhǎng)過(guò)程中的處理 ，也能取得一定效果 。 5 抗生素 作為誘變劑的抗生素主要有 鏈黑霉素 、 爭(zhēng)光霉素 、 絲裂霉素 、 放線菌素 、 正定霉素 、 光輝霉素和阿霉素 等 。 這些抗生素都是抗癌藥物 ， 它們?cè)谖⑸镉N中雖有應(yīng)用 ， 但效果不如烷化劑等誘變劑顯著 ， 應(yīng)用并不廣泛 。 一般不單獨(dú)使用 ，常與其他誘變劑一起復(fù)合使用 。 重視化學(xué)誘變劑的操作安全 化學(xué)誘變劑多數(shù)是極毒的致癌藥品 ， 在進(jìn)行誘變操作后的處置以及誘變劑的保藏等方面的安全防護(hù)都是極其重要的 。如有疏忽 ， 就可能對(duì)健康和環(huán)境帶來(lái)惡果 ， 萬(wàn)萬(wàn)不可麻痹 。使用化學(xué)誘變劑一般要求避光 、 密封 、 低溫 、 干燥等：盡可能不觸及人體任何部位；對(duì)殘余物要及時(shí)進(jìn)行消毒 、 稀釋處理 。 第五節(jié) 誘變生成過(guò)程 一、突變的修復(fù) ?光修復(fù) ?切補(bǔ)修復(fù)（暗修復(fù)） ?重組修復(fù)（ Rec修復(fù)） ?SOS修復(fù) （一） 復(fù)制修復(fù) ?DNA聚合酶的 3?→ 5?的校正系統(tǒng) ?N糖基酶修復(fù)系統(tǒng)（堿基切除修復(fù)） ?錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng) （二）損傷修復(fù) 特殊條件下，極少數(shù)錯(cuò)誤堿基遺留未被糾正，錯(cuò)誤頻率 108 DNA多聚酶的校讀功能 修復(fù)發(fā)生階段： DNA聚合過(guò)程中 尿嘧啶 N糖基酶修復(fù)系統(tǒng) 參與的酶 —— 尿嘧啶 N糖基酶、 AP限制性內(nèi)切酶、核酸外切酶、 DNA聚合酶 Pol、 DNA連接酶。 修復(fù)發(fā)生階段：復(fù)制過(guò)程中和復(fù)制完成后的較短時(shí)間之內(nèi) 錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng) 修復(fù)發(fā)生階段：復(fù)制過(guò)程中和復(fù)制完成后的較短時(shí)間之內(nèi) 錯(cuò)誤堿基的位置：存在于新生 DNA鏈的內(nèi)部 修復(fù)范疇 :第二次糾錯(cuò) 修復(fù)方式：復(fù)制修復(fù) 識(shí)別錯(cuò)配的堿基對(duì)，切除錯(cuò)誤的堿基，并進(jìn)行修復(fù)合成 甲基化引導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)特異性不強(qiáng)，基本上能修復(fù)DNA雙鏈結(jié)構(gòu)中任何輕微的損傷，包括錯(cuò)配、移碼、堿基類(lèi)似物的替代等 甲基化引導(dǎo)的錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng) 光修復(fù) 紫外線照射，形成嘧啶二聚體 藍(lán)光激活光復(fù)活酶，修復(fù)嘧啶二聚體。 機(jī)制：光復(fù)活酶（ photoreactivating enzyme， PR酶，由 phr基因編碼），催化嘧啶二聚體分解成為單體 有效波長(zhǎng)為 400nm左右 切補(bǔ)修復(fù) 一般可先切后補(bǔ)和先補(bǔ)后切。這兩種修復(fù)過(guò)程中都是在限制性內(nèi)切核酸酶、外切核酸酶、 DNA聚合酶及連接酶協(xié)同作用下進(jìn)行的。整個(gè)修復(fù)過(guò)程不需要可見(jiàn)光，在黑暗條件下就可以修補(bǔ)。因此也稱(chēng)為暗修復(fù)。 切補(bǔ)修復(fù) 是細(xì)胞的主要修復(fù)系統(tǒng)，發(fā)生在DNA復(fù)制之前，是對(duì)模板的修復(fù)。 重組修復(fù) 是指損傷的 DNA經(jīng)過(guò)復(fù)制后完成修復(fù)過(guò)程。 重組修復(fù) 重組修復(fù)是嚙齒動(dòng)物主要的修復(fù)方式 SOS修復(fù) 系統(tǒng) 為一個(gè)傾向差錯(cuò)的修復(fù)系統(tǒng)，該系統(tǒng)與DNA聚合酶相互作用，使之通過(guò)嘧啶二聚體繼續(xù)復(fù)制DNA。在修復(fù)過(guò)程中 3?—5?校正讀碼能力的酶被抑制，結(jié)果堿基能隨機(jī)插入二聚體的對(duì)面，沒(méi)有精確的堿基對(duì)，這個(gè)機(jī)制是紫外線之所以致突變的主要原因，因?yàn)榇蠖鄶?shù)的其它系統(tǒng)是精確修復(fù) DNA的。 SOS修復(fù)