【文章內(nèi)容簡介】 放射性同位素或加速器 電子（帶“ +”或“ ”） 幾百萬 eV 有時有危險 ＜ 1cm α粒子 放射性同位 素 氦核，電離 密度大 幾百萬 eV 照射內(nèi)很危險 ＜ 1cm (一 ) 電離輻射 電離輻射：當 量子能量達到 120eV 以上時 , 對物體有電離作用 , 能導致機體的嚴重損傷 , 這類輻射稱為電離輻射 常用于微生物誘發(fā)突變的電離輻射有快中子 、 X射線和 γ射線等 。 電離輻射的作用機制還不能做出圓滿解釋 。 存在兩種假說 ，即所謂的 直接物理作用假說與間接化學作用 (輻射裂解水分子產(chǎn)生自由基而起作用 )假說 。 電離輻射主要引起 DNA上的 基因突變和染色體的畸變 ； 電離輻射的作用機制 電離輻射的劑量 快中子的劑量通常以拉德（ rad）表示 在誘變育種中快中子照射的致死率達到 50%85%比較合適，采用的誘變劑量大約在 1530krad（千拉德）。不同種類菌種最適當劑量范圍是不同的。 1rad=100erg/g=。 X射線和 γ射線的劑量通常以倫琴 (R)來表示 由于 X射線和 γ射線穿透能力很強，對細胞致死作用比紫外線和一般的化學誘變劑表現(xiàn)更為強烈，因此，它們不適宜像紫外線那樣進行反復多次照射。一般常用的劑量掌握在殺菌率 90％ ％ 為宜，切忌用高劑量進行處理。 1cm3干燥空氣征 0℃ ， 105Pa(760mmHx氣壓下 )產(chǎn)生 。 直接對 平皿 上生長的菌落進行 照射 ， 或者用直徑 610mm的打孔器把菌落連瓊脂一同取出 ， 置于滅菌平皿內(nèi)進行照射；也可制成 菌懸液 ， 取 12mL置于試管內(nèi)并浸入冰水中 ， 從上或側(cè)面或下向進行短時間照射 。 試管內(nèi)的菌懸液不宜過多 ， 否則液層太厚 ， 氧氣供給不足 ， 誘變效應和重復性都將比較差 。處理完畢后 ， 把盛有菌體細胞的試管繼續(xù)冰浴 23h。 低溫可降低或抑制修復酶的活性 ， 防止突變體因修復酶的修復而還原為正常細胞 。 這一操作除用于 γ射線外 ， 也可用于紫外線和其他化學誘變劑 ， 可以獲得同樣的效果 電離輻射的照射方法 非電離輻射：當 量子能量小于 120eV 的不足以引起生物體電離的電磁輻射 ， 稱為非電離輻射 常用于微生物誘發(fā)突變的非電離輻射有： (1) 射頻輻射。射頻輻射稱為無線電波 , 量子能力很小。按波長和頻率 , 射頻輻射可分成 高頻電磁場、超高頻電磁場和微波 3 個波段。 (2) 紅外線輻射。 (3) 紫外線輻射。 （二）非電離輻射 非電離輻射主要導致形成 嘧啶二聚體 。 同一種輻射線對不同微生物的效應不一樣 ， 這與每種 微生物修復系統(tǒng) 的強弱有關(guān) 。它們引起 微生物的變異或死亡與輻射劑量成正比 。 非電離輻射的作用機制 紫外線的作用機制 (1)紫外線的 有效光譜 紫外線的光譜范圍在 40390nm， 能誘發(fā)微生物突變的紫外線的有效波長范圍是 200300nm。 最有效的波長為 。 一般用來滅菌消毒的 30W紫外燈管 ， 光譜分布范圍廣 ， 較平均 ， 誘變效率較差 。 而 15W紫外燈管 ， 放射出來的紫外線大約有 80%波長集中在 ， 因此誘受效應比 30W的好 。 紫外線誘變的方法 (2)紫外線的 輻射劑量 用于微生物誘變的紫外線劑量的表示方法 ， 可分絕對劑量和相對劑量 。 絕對劑量需要用一種劑量儀來測定 ， 由于操作比較困難 ， 在誘變育種的實際工作中不常被采用 。 相對劑量單位用照射時間或者殺菌率表示 。 根據(jù)育種工作者長期的研究和實踐經(jīng)驗 ， 一般認為殺菌率以90%%效果較好 。 但也有報道 ， 認為較低的殺菌率有利于正突變菌株的產(chǎn)生 ， 以 70%80%或更低的殺菌率為好 。 紫外線 照射劑量與殺菌率在一定范圍內(nèi)成正比 ， 劑量越高 ，殺菌率也越高 ， 在殘存的細胞中變異幅度也廣；反之劑量越低 ， 殺菌率也越低 ， 在殘存細胞中變異幅度也小 。 因此 ， 在照射過程中可加大劑量 ， 但又要采取減少死亡率和提高誘變效果的措施 。 使用誘變效果好的低功率 15W紫外燈管 2支 ， 并安裝在放光的燈罩內(nèi) ， 使 細胞上 ， 可以提高變異率 。 另一種辦法是把 照射劑量提高到超致死量的程度 ， 與可見光交替進行 ， 利用光修復使損傷的細胞恢復 ， 減少死亡率 ， 增加變異幅度 。 一般采用 30W紫外燈管 ， 光復活的效果較好 ， 或者在預培養(yǎng)基中增加一定量的咖啡因或蛋白陳 ， 也可以降低此亡率 。 (3)紫外線誘變的 步驟與方法 ： 1)出發(fā)菌株 ， 把細菌斜面培養(yǎng)到對數(shù)期 ， 霉菌或放線菌則培養(yǎng)到孢子剛成熟 。 2)前培養(yǎng) ， 對細菌類以肉湯為主 ， 適量加入核酸類物質(zhì)或酵母膏等制成營養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基 ， 同時還可加入抑制修復的物質(zhì) ，如咖啡堿或異煙胺等 。 將菌體培養(yǎng)到最佳生理狀態(tài) (對數(shù)期 )，約 1624h；霉菌 、 放線菌培養(yǎng)到絕大部分孢子剛剛萌發(fā) 。 3)制備菌懸液 ， 離心除去培養(yǎng)基 ， 用生理鹽水制備菌懸液 、 加入玻璃珠振蕩分散 ， 以無菌濾紙或脫脂棉過濾 ， 使形成單細胞 ， 分散程度達 90%95%。 要求菌懸液濃度：細菌約 1 108個/mL， 放線菌約 107108個 /mL， 霉菌約 106107個 /mL。 4)紫外線照射 ， 取以上制備好的菌懸液 3mL于直徑 7cm的平底平皿中 (直徑 9cm平皿 ， 約加 56mL)。 紫外燈打開預熱 20min，以穩(wěn)定光波 。 將盛有菌懸液的平皿放到磁力攪拌器上 ， 離燈管一定距離 ， 打開皿蓋 ， 暴露紫外光下照射一定時間 ， 邊攪拌邊照射 ， 力求使細胞均勻吸收紫外線光波 。 以上照射過程必須在備有黃光或紅光的暗室內(nèi)進行 ， 以免光修復 。 據(jù)國外報道 ， 經(jīng)過紫外線誘變后的菌體 (特別是細菌 、 放線菌 )轉(zhuǎn)入到無菌試管內(nèi) ， 并立即浸入冰水中 12h， 在低溫條件下 ， 細胞內(nèi)參與對突變體修復的各種酶類活性受到抑制 ， 使修復難以進行 ， 有利于提高突變率 。 5)后培養(yǎng) ， 根據(jù)延遲現(xiàn)象的原理 ， 照射完畢的菌懸液加入到適合于正突變體增值的培養(yǎng)基中 ， 在適宜溫度下培養(yǎng) 。有些微生物在增殖培養(yǎng)基中加人適量的酪素水解物 、 色氨酸或異煙肼等物質(zhì) ， 可以抑制修復 ， 有利于突變體繁殖和減少細胞懸液在貯存過程中的死亡 ， 能明顯提高突變率 。 6)稀釋涂皿 ， 后培養(yǎng)結(jié)束后 ， 從中取一定量培養(yǎng)物 ， 作不同稀釋度 ， 涂皿 ， 并且以未經(jīng)紫外線照射過的菌懸液作對照皿 ，培養(yǎng)后 ， 桃取菌落 ， 以待篩選 。 微波 微波是一種電磁波 ， 其生物學效應分為熱效應和非熱效應 。有人研究了微波誘變大腸桿菌和米曲霉的生物學效應 。 在輻射過程中采用分散低溫干燥法 ， 消除微波熱效應的影響 。 發(fā)現(xiàn)微波對微生物有一定的致死能力和誘變效應 。 選擇適當?shù)膭┝亢蜆悠诽幚矸椒?， 可起到較好的誘變效果 。 (三 )其他物理誘變劑 紅外射線 應用紅外輻射和紫外輻射對果膠酶產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體和孢子進行誘變 ， 發(fā)現(xiàn)紅外輻射能促進菌體代謝 ， 提高對紫外損傷的抗性 。 在紫外線中增加紅外輻射可顯著提高誘變效果 。紅外輻射產(chǎn)生的突變株產(chǎn)酶性能顯著高于對照親株 ， 說明紅外輻射是有效的微生物物理誘變因子 。 激光 激光是一種光量子流 ， 又稱光微粒 。 科學家 1968年提出小劑量輻射對生物有刺激效應的研究理論后 ， 激光應用于生物學領(lǐng)域的成就備受人們的關(guān)注 。 激光輻射可以通過產(chǎn)生閃 、熱 、 壓力和電磁場效應的綜合作用 ， 直接或間接地影響生物有機體 。 引起 DNA、 染色體畸變效應 ， 酶的激活和鈍化以及細胞的分裂和細胞代謝活動的改變等 。 除紫外波段的激光有誘變作用外 ， 可見光 ~紅光波段間的激光也有誘變作用 。 曾有人用激光照射棉病囊霉引起突變而產(chǎn)生核黃素 ， 對釀酒酵母 CO2激光誘變育種 ， 發(fā)現(xiàn)對酵母菌乙醇代謝的改變有刺激效應 。 目前激光成為微生物的常用誘變劑 。 高能電子流 高能電子流是較強的電離輻射線 ， 在抗生素菌種選育中都采用這種誘變劑 ， 普遍接受的誘變劑量為殺菌率 90%%。在林可霉素產(chǎn)生菌林可鏈霉菌的誘變育種工作中 ， 采用高能電子流誘變時 ， 70%90%的殺菌率為最佳劑量 。 用高能電子輻射果膠酶產(chǎn)生菌的原生質(zhì)體進行誘變 ， 選出變異株 ， 產(chǎn)酶性能顯著優(yōu)于親株 。 離子注入 離子注人是 20世紀 80年代初興起的一種材料表面處理的高新技術(shù) ， 主要用于金屬材料表面的改性 。 1986年被用于農(nóng)作物育種 ， 現(xiàn)在逐漸應用于多種農(nóng)作物 。 所謂離子注入誘變 ，就是利用離子注入生物體引起遺傳物質(zhì)的改變 ， 導致性狀的變異 ， 從而達到育種的目的 。 離子注人法作為一項新的生物誘變技術(shù)而引起國內(nèi)外學者的極大關(guān)注 。 離子注人和其他常規(guī)誘變及化學誘變過程有明顯的差異 。 其他輻射誘變僅僅是利用能量的交換 ， 化學誘變劑也只是分子基團的交換 ， 而離子注入在誘變生物學效應上有著明顯的優(yōu)點： 我國 1994年報道了離子注入鏈霉菌的誘變效應 ， 證明離子注入法的高突變率 ， 獲得 %的正突變率 。 1995年又有報道指出 ， 采用 N+和 C4+注入核糖霉素產(chǎn)生菌 、 卡那霉素抗性產(chǎn)生菌時 ， 其中以 N+的誘變效果最顯著 。 1997年 ， 又有報道 N+注入紅霉素產(chǎn)生菌的誘變效應 ， 認為離子注入產(chǎn)生的自由基對生物效應基本上無影響 。 離子注入右旋糖酐產(chǎn)生菌 ， 得到產(chǎn)量提高 %的變株 。 有關(guān)離子注入的誘變機制研究工作仍在進行 ， 它是一類高效 、 方便 、 安全無污染的新型誘變源 ， 將引起越來越多的育種工作者的重視 。 二、化學誘變劑 化學誘變劑是一類能對 DNA起作用 、 改變其結(jié)構(gòu) 、 并引起遺傳變異的化學物質(zhì) 。 化學誘變劑主要包括四大類：堿基類似物 、 烷化劑 、 移碼突變劑以及其他種類等 。 化學誘變劑的作用機制都是與 DNA起化學作用 ， 誘變效應和它們的理化特性有很大關(guān)系 ， 使用前必須認真了解和掌握 。 這些 化合物的穩(wěn)定性以及影響其穩(wěn)定性的條件 ，如溫度、光照、pH的影響、 化合物的半衰期以及與溶劑或增溶劑是否起反應 等 使用化學誘變劑時應注意： 絕大