【正文】 空間構(gòu)象并非生物活性的唯一影響因素 【 舉例 】 低溫下酶活性低，但并不影響構(gòu)象；鹽析時沉淀的酶無活性，但構(gòu)象不變。 蛋白構(gòu)象疾?。?錯誤構(gòu)象相互聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀，產(chǎn)生毒性而致病。 ?老年癡呆 ?瘋牛病 ?亨汀頓舞蹈病 蛋白質(zhì)的變性與復(fù)性 去除部分變性劑 溫和復(fù)性 溫和復(fù)性 天然蛋白 （具有正確的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，因此具有生物活性） 變性蛋白 （ 具有正確的一級結(jié)構(gòu)但無高級結(jié)構(gòu) ， 無生物活性 ） 變性環(huán)境 非天然蛋白 （ 具有正確的一級結(jié)構(gòu)和錯誤的高級結(jié)構(gòu) ， 無生物活性 ） 【 經(jīng)典舉例 】 Rnase 蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài) 前體蛋白與活性蛋白的轉(zhuǎn)變 （切除冗余及其它變化） 前體蛋白 （一級結(jié)構(gòu)冗余，高級結(jié)構(gòu)錯誤，因此無生物活性） 活性蛋白 （具有正確的一級結(jié)構(gòu)和高級結(jié)構(gòu)，因此具有生物活性） 適合環(huán)境 【 經(jīng)典舉例 】 酶原激活：胃蛋白酶原切除 N端 42個氨基酸后形成活性中心及其他空間構(gòu)象，轉(zhuǎn)變?yōu)榫咚獾鞍踪|(zhì)活性的胃蛋白酶；胰蛋白酶原切除 N端 6個氨基酸后形成活性中心及其他正確構(gòu)象，轉(zhuǎn)變?yōu)榫哂兴饣钚缘囊鹊鞍酌浮? 蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài) 分子病（ molecular disease）：由于基因結(jié)構(gòu)改變，蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)中的關(guān)鍵氨基酸發(fā)生改變，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能障礙，出現(xiàn)相應(yīng)的臨床癥狀，這類遺傳性疾病稱為分子病。 【經(jīng)典舉例】鐮形細(xì)胞貧血癥：編碼血紅蛋白 β亞基的結(jié)構(gòu)基因第六個密碼子由 CTT→CAT ，相應(yīng)的多肽序列中 N端的第六個氨基酸由 Glu→Vla ；其空間結(jié)構(gòu)發(fā)生相應(yīng)改變，在表面形成互補區(qū)，使蛋白質(zhì)分子之間彼此聚合，促使紅細(xì)胞在低氧壓下變形成鐮形，喪失運輸氧的生物活性 。 蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài) 蛋白構(gòu)象疾?。函偱２?，由于朊病毒蛋白（ PrP）構(gòu)象改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集，形成抗蛋白水解酶的淀粉樣纖維沉淀。 （二級結(jié)構(gòu)及其它變化） 正常動物 PrPc （ 二級結(jié)構(gòu)多為 α 螺旋、對蛋白酶敏感、水溶性 ） 致病蛋白 PrPsc （一級結(jié)構(gòu)相同，但二級結(jié)構(gòu)全為 β折疊，抗蛋白酶、水溶性差、蛋白聚集成淀粉樣沉淀） 未知蛋白 蛋白質(zhì)的活性狀態(tài)與非活性狀態(tài) 第五節(jié) 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)及分離純化 兩性解離與等電點：同“氨基酸兩性解離” 紫外吸收：最大吸收波長＝ 280nm 膠體性質(zhì)：不能透過半透膜 沉淀、凝固 ?蛋白質(zhì)在溶液中維持穩(wěn)定的因素： 表面電荷、水化層（溶劑化層） ?變性蛋白不一定沉淀，沉淀蛋白也不一定變性 一、理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的變性作用： （ 1）沉淀： 不穩(wěn)定蛋白質(zhì)從溶液中析出 （ 2）結(jié)絮： 變性蛋白質(zhì)不一定發(fā)生沉淀，因為電荷穩(wěn)定因素未被破壞，當(dāng)調(diào)節(jié) PH到等電點，立即結(jié)成絮狀不溶物的現(xiàn)象。 絮狀沉淀可溶于強酸、強堿 （ 3）凝固： 絮狀沉淀如加熱，則變成堅固的凝塊，不能再溶 于強酸、強堿的現(xiàn)象 （ 1）變性： 在某些理化因素作用下，蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)被破壞，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變、生物活性喪失的現(xiàn)象稱為變性。變性不涉及一級結(jié)構(gòu)的變化。 ?理化性質(zhì)的變化：紫外吸收、化學(xué)活性及粘度上升，易被蛋白酶水解；溶解度下降、結(jié)晶能力喪失。 變性 (denaturation)、復(fù)性 (renaturation) （ 2）復(fù)性 （ 3）應(yīng)用 ①利用變性： ?酒精消毒 ?高壓滅菌 ?②防止變性：低溫保存生物制品 ③取代變性：乳品解毒 (用于急救重金屬中毒 ) 呈色反應(yīng)：雙縮尿反應(yīng)，等 ?雙縮尿反應(yīng)可檢測蛋白質(zhì)的水解程度 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （一）根據(jù)分子大小不同的分離方法 ：蛋白質(zhì)溶液裝在半透膜的透析袋里，放在蒸餾水中，蛋白質(zhì)溶液中無機鹽小分子通過透析袋擴散入純水中 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （一）根據(jù)分子大小不同的分離方法 ：利用外壓或離心力使水和其他小分子通過半透膜，蛋白質(zhì)留在膜上 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （一）根據(jù)分子大小不同的分離方法 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （一）根據(jù)分子大小不同的分離方法 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （二）根據(jù)溶解度差異的分離方法 蛋白質(zhì)在等電點時凈電荷為零 分子間的靜電斥力減少 容易聚集而沉淀 溶解度最小 2. 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （二）根據(jù)溶解度差異的分離方法 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （三）根據(jù)電荷不同的分離方法 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （三）根據(jù)電荷不同的分離方法： 離子交換樹脂 3. SDSPAGE電泳法法測定蛋白質(zhì)的分子量 在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn) SDS（十二烷基磺酸鈉）， SDS能斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級結(jié)構(gòu)，強還原劑能使半胱氨酸之間的二硫鍵斷裂。 蛋白質(zhì)與 SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的 SDS蛋白質(zhì)復(fù)合物 ，這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的 SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成僅保持原有分子大小為特征的 負(fù)離子團塊 ，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決于分子大小。當(dāng)分子量在 15KD到 200KD之間時，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （四）吸附層析 硅膠、氧化鋁、活性炭 吸附力的強弱不同 非極性吸附劑：范德華力和疏水相互作用 極性吸附劑 :離子鍵、氫鍵 二、蛋白質(zhì)的分離純化 （五）親和層析 二、蛋白質(zhì)的分離純化 透析、超濾 ?根據(jù)性質(zhì)：分子大小 鹽析（ salting out） ?根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的沉淀 ?作用機理：中性鹽中和表面電荷，破壞水化層 ?影響因素：表面電荷、水化層、溶劑性質(zhì) 電泳： ?根據(jù)性質(zhì)：蛋白質(zhì)的兩性解離 ?作用機理：異性電荷互相吸引 ?影響因素：電荷種類及數(shù)量、分子大小及形狀、溶液離子強度及 pH等 層析 （ 1）離子交換層析：電荷、分子量、分子形狀 （ 2）親和層析：生物特性 （ 3）吸附層析：吸附特性 （ 4）分子篩（凝膠過濾層析）：分子大小及形狀 ?大分子先洗脫下來 超速離心：分子大小及形狀、溶液特性 第六節(jié) 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)分析 重要內(nèi)容： 重要名詞： isoelectric point； motifs； domain。 subunit； allosteric effect。 protein denaturation。 molecular disease 結(jié)構(gòu)層次 ?元素組成： C、 H、 O、 N（ 16%）、 S ?結(jié)構(gòu)單位： 20種 Lα氨基酸（芳香族、含硫、酸性、堿性氨基酸等） ?一級結(jié)構(gòu) ： 肽鍵；多肽鏈； N端 ?C端 ?二級結(jié)構(gòu)：穩(wěn)定力（氫鍵）；類型（ ?螺旋， ?折疊， ?轉(zhuǎn)角，無規(guī)卷曲） ?三級結(jié)構(gòu)特點 ?四級結(jié)構(gòu)特點 重要性質(zhì)： 兩性解離及帶電狀態(tài)判定；紫外吸收；沉淀；變性 分離純化： 超濾；鹽析；電泳；親和層析；離子交換層析；分子篩 結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系（舉例）