【正文】 。其結(jié)構(gòu)為： ? 2． N,O雙 (三甲基硅 )三氟乙酰胺 （ BSTFA） ? 室溫為液體，既可單獨使用，也能與 TMCS等催化劑共同使用，其應(yīng)用最廣，反應(yīng)副產(chǎn)物三氟乙酸和三甲基硅三氟乙酰胺的揮發(fā)性很強(qiáng)，出現(xiàn)在 GC的前沿，不干擾測定。其結(jié)構(gòu)為： 常用的硅烷化試劑 ? 3． N甲基 N三甲基硅三氟乙酰胺 （MSTFA） ? 沸點 132℃ ，已成為最重要的一種硅烷化試劑，反應(yīng)副產(chǎn)物比 BSTFA的副產(chǎn)物揮發(fā)性還強(qiáng)，試劑本身分子極性強(qiáng)，硅烷化能力強(qiáng)，能與氨基酸或胺的鹽酸鹽作用。其結(jié)構(gòu)為： 常用的硅烷化試劑 ? 4． N三甲基硅二乙胺 （ TMSDEA） ? 是中等強(qiáng)度的硅烷化試劑，強(qiáng)堿性，強(qiáng)揮發(fā)性，很適合于低分子羧酸和氨基酸的硅烷化，TMSDEABSTFATMCS吡啶（ 30+99+1+1000）能使酪氨酸和色氨酸的酸性、堿性、中性代謝物同時硅烷化。其結(jié)構(gòu)為： 常用的硅烷化試劑 ? 5．三甲基硅咪唑 （ TMSIM） ? 是羥基化合物的最強(qiáng)硅烷化試劑，不與脂肪胺反應(yīng)，揮發(fā)性較差，在 GC或 GCMS分析前需對硅烷化產(chǎn)物進(jìn)行純化。其結(jié)構(gòu)為： 硅烷化注意事項 ? 硅烷化反應(yīng)總是在密閉小瓶中進(jìn)行，因為所有硅烷化試劑及其衍生物都很易受濕氣的水解作用， TMS更易水解。 ? 大多數(shù)情況下試劑本身就是很好的溶劑，需要溶劑時應(yīng)當(dāng)避免使用含有活潑氫的溶劑。 ? 吡啶是最合適的溶劑，其他還有二甲基甲酰胺，二甲基亞砜和四氫呋喃等也能作硅烷化反應(yīng)的介質(zhì)。 酯化衍生化方法 ?羧酸為什么要衍生化 ? 羧酸的 極性較強(qiáng) ，常與 GC的“惰性”固定相發(fā)生非特異性作用， 產(chǎn)生拖尾峰 ；羧酸的 揮發(fā)性也差 ，由于締合作用，其揮發(fā)性比按分子量大小預(yù)計的還要弱，因此難于用GC直接分析羧酸。而羧酸酯的極性較弱，揮發(fā)性也強(qiáng)，很符合 GC的要求，所以許多羧酸在 GC測定之前都要衍生化成相應(yīng)的酯，最常用的是甲基酯。 1．甲基酯化反應(yīng) ? 重氮甲烷法： 反應(yīng)在非水介質(zhì)中進(jìn)行，因為重氮甲烷能與水反應(yīng)。此反應(yīng)的速度快、產(chǎn)率高、很少副反應(yīng)，而且反應(yīng)條件比較溫和。但是重氮甲烷不穩(wěn)定，具有 爆炸性 ，而且有 致癌 作用，制備和使用時應(yīng)特別小心，并以少量進(jìn)行試驗為宜。常溫下酚羥基也能與重氮甲烷緩慢反應(yīng)，因此含有酚羥基的羧酸進(jìn)行甲酯化時可能有副反應(yīng)，但是冷卻到 0℃以下就可避免酚羥基的反應(yīng)。 1．甲基酯化反應(yīng) ? 甲醇法 以甲醇作為酯化試劑，反應(yīng)往往需要催化劑，常用鹽酸、硫酸、 BF BC13或酸酐作催化劑，以 BF3為催化劑時反應(yīng)在數(shù)分鐘內(nèi)即可完成。通常將這些催化劑制成一定濃度的甲醇溶液。例如，氨基酸的甲酯化是將 mg量的樣品與 2mL 14mol/L的鹽酸甲醇溶液反應(yīng)，在 70℃ 進(jìn)行 2h。 ? 三氟乙酸酐法 在三氟乙酸酐的存在下有機(jī)酸和醇可以反應(yīng)生成酯 ? RCOOH + R’OH RCOOR’+H20 此法特別適于空間位阻較大的有機(jī)酸和醇或酚的酯化。 ? (4)其他酯化方法 為了提高方法的靈敏度和選擇性，有時需要制備甲酯以外的酯，這些酯化方法有的類似于甲酯化反應(yīng)，如以重氮乙烷、重氮丙烷、重氮甲苯代替重氮甲烷，可制得相應(yīng)的酯。而且這些試劑穩(wěn)定性好、爆炸性小。用 BF3的丙醇、丁醇或戊醇溶液與有機(jī)酸反應(yīng)，也可制備相應(yīng)的丙酯、丁酯或戊酯。 ?；苌椒? ? 為什么要?；? ?；芙档土u基、氨基、巰基的極性，改善這些化合物的色譜性能，?；€能增加氨基酸、糖類等化合物的揮發(fā)性，也能使兒茶酚胺等易于氧化的化合物的穩(wěn)定性增強(qiáng)。另外，電子捕獲檢測器（ ECD）是 GC的最靈敏檢測器，適合于低濃度分析，如果通過?；磻?yīng)引入含有鹵原子的?；湍苓M(jìn)一步提高 ECD檢測的靈敏度。 ? ?；噭┯腥?： 酰鹵、酸酐和有反應(yīng)活性的?；锶缫阴＿溥颍瑧?yīng)根據(jù)需要進(jìn)行選擇。 ?；苌椒? 1．乙?；磻?yīng) ? 標(biāo)準(zhǔn)的乙?；襟E是：將樣品溶于氯仿（ 5mL），與 醋酐和 1mL醋酸在 50℃ 下反應(yīng) 2～ 6h后，真空除去剩余試劑。還可以用醋酸鈉為堿性催化劑，以醋酐為乙酰化試劑，這一反應(yīng)曾用于分析尿樣中分離得到的糖類化合物。吡啶是另一堿性催化劑，在氨基酸的 GC分析中，先將氨基酸制成正丙酯，再在室溫下與醋酐 吡啶（ 1+4）反應(yīng)10min，即得產(chǎn)物乙酰氨基酸正丙酯。其他的堿性催化劑包括三乙胺和 N甲基咪唑。乙酰化反應(yīng)通常在非水介質(zhì)中進(jìn)行，但是胺類和酚類的乙?；部稍谒芤褐羞M(jìn)行，因為它們的反應(yīng)比水快得多。 ?；苌椒? 2．多氟?；磻?yīng) ? 最常用的多氟酰化反應(yīng)是 三氟乙酰（ TFA） 、 五氟丙酰（ PFP）和七氟丁酰（ HFB） 化。 ? 反應(yīng)活性是 TFAPFPHFB， ? TFA或 PFP衍生物的揮發(fā)性較強(qiáng)， ? 而 HFB衍生物的 ECD檢測靈敏度最高。 ? 從文獻(xiàn)看有一種趨勢，即 TFA常用于氨基酸的衍生化，只為了增加其揮發(fā)性，而不以 ECD檢測。 ? PFP用于含有酚羥基的胺類， ? 而 HFB用于甾體化合物， ? 它們的共同優(yōu)點是剩余試劑很容易揮發(fā)除盡。 第七章 衍生化技術(shù) 第一節(jié)、 衍生化的目的與條件 第 二 節(jié) 、 氣相色譜中常用的柱前衍生化方法 第 三 節(jié) 、 液相色譜中常用的柱前衍生化方法 第 四 節(jié) 、 固相化學(xué)衍生化法 第 五 節(jié) 、 衍生化反應(yīng)所需設(shè)備及注意事項 第 六 節(jié) 、 衍生化技術(shù)的應(yīng)用 第三節(jié)、液相色譜中常用的柱前衍生化方法 ? 可見 紫外衍生化 ? 液相色譜使用最多的是紫外檢測器，為了使一些沒有紫外吸收或紫外吸收很弱的化合物能被紫外檢測器檢測，往往是通過衍生化反應(yīng)在這些化合物的分子中引入有強(qiáng)紫外吸收的基團(tuán) ? 許多重要藥物并沒有強(qiáng)的可見 紫外（ VisUV）吸收，為了能用可見 紫外檢測器進(jìn)行檢測，需將強(qiáng)發(fā)色團(tuán)引入到這些化合物中。 可見 紫外衍生化 ? 可見 紫外衍生化 ? 可見 紫外衍生化試劑的種類很多，總體來說它們都是高度共軛的芳香化合物。下面按被測化合物類別來介紹它們的衍生化試劑。 可見 紫外衍生化 ? 苯甲酰氯及其衍生物 —— 對硝基苯甲酰氯， 3， 5二硝基苯甲酰氯和對甲氧基苯甲酰氯都可以同 胺、醇和酚 類化合物反應(yīng)，生成強(qiáng)紫外吸收的苯甲酸酯類衍生物，反應(yīng)如下： ? 過量試劑可以通過水解除去，反應(yīng)產(chǎn)物可用有機(jī)溶劑提取后直接進(jìn)樣。 可見 紫外衍生化 ? 和苯甲酰氯一樣，芳基磺酰氯也能與 伯胺和仲胺 反應(yīng)，而且反應(yīng)條件也很相似。甲苯磺酰氯（ TSCl）與 多氨基化合物 反應(yīng)后不僅提高它的檢測靈敏度，而且改善 HPLC分離度。反應(yīng)時將甲苯磺酰氯溶于丙酮并加入 酸氫鈉溶液，維持 70℃ ，反應(yīng) 1h。反應(yīng)物用氯仿提取，在254nm波長處檢測。剩余 TSCl對某些產(chǎn)物的測定有干擾，因此需用正己烷洗滌除去。 ? 苯磺酰氯（ BSC1）曾用作慶大霉素的衍生化試劑。二甲胺基偶氮苯磺酰氯（ DABSCl）是氨基酸的一種衍生化試劑，反應(yīng)產(chǎn)物的最大吸收在 420～ 450nm，在這一波長范圍內(nèi)檢測生物樣品時，能減少內(nèi)源性物質(zhì)的干擾。 可見 紫外衍生化 ? 2， 4一二硝基氟代苯 (DNFB) 與醇的反應(yīng)產(chǎn)率很低，但可與大多數(shù) 伯胺、仲胺 和 氨基酸反應(yīng)，生成強(qiáng)紫外吸收的苯胺類衍生物 ? 1氟 2,4二硝基苯（ FDNB）曾用于氨基糖苷類抗生素如新霉素、福替霉素、丁胺卡那霉素、托普霉素、慶大霉素和西索咪星等的衍生化。 可見 紫外衍生化 ? ? 異氰酸苯酯（ PIC）與 伯胺 和 腫胺 形成 N,N/取代脲，反應(yīng)在二甲基甲酰胺中進(jìn)行，數(shù)分鐘內(nèi)定量衍生。 異氰酸萘酯（ NIC）能與氨基酸 反應(yīng)，衍生物可以用紫外或熒光檢測器檢測。 可見 紫外衍生化 ? ? 異硫氰酸苯酯（ PITC）與氨基酸的衍生化反應(yīng)，據(jù)條件不同有兩種反應(yīng)產(chǎn)物。一種產(chǎn)物是苯基硫代氨基甲酰（PTC)氨基酸，衍生化試液是乙醇 三乙胺 水 PITC（7+1+1+1），臨用前新鮮配制。樣品需預(yù)先干燥，室溫反應(yīng) 5min即可完成。衍生物的分離主要在 C18柱上進(jìn)行，在254nm檢測。 ? 一種為苯基乙內(nèi)酰硫脲（ PTH），此反應(yīng)涉及到氨基和羧基，即生成 PTC氨基酸后，進(jìn)一步轉(zhuǎn)化成更穩(wěn)定的 PTH： 可見 紫外衍生化 ? ? 苯基異硫氰酸酯與 醇類 反應(yīng)生成苯基甲酸酯 可見 紫外衍生化 ? ? 茚三酮是氨基酸自動分析儀的柱后衍生化試劑，也可用于其它色譜分離氨基酸的柱后衍生化。對硝基芐基溴（ pNBBr）是測定脂肪叔胺的衍生化試劑。 可見 紫外衍生化 ? ? 有機(jī)酸 很容易與酰溴基反應(yīng)生成酯，常用的酰溴基試劑有苯甲酰溴，萘甲酰溴、甲氧基苯甲酰溴、對溴基苯甲酰溴和對硝基苯甲酰溴等。如： ? 酯化反應(yīng)應(yīng)在極性溶劑 (如乙腈，丙酮或四氫呋喃 )中進(jìn)行，有時需加催化劑，如冠醚加鉀離子、三乙胺或 N二異丙基胺等。 可見 紫外衍生化 ? 7. 2,4二硝基苯肼（ 2,4DNPH） ? 2,4二硝基苯肼（ 2,4DNPH）是較早應(yīng)用于酮、醛、羰基甾體和糖等 羰基化合物 的可見 紫外衍生化試劑，產(chǎn)物為苯腙化合物，其反應(yīng)式為： 熒光衍生化 ?為什么要熒光衍生化 ? HPLC的熒光檢測器靈敏度比紫外檢測器高得多，適合半痕量分析。 ? 大多數(shù)藥物及生命重要物質(zhì)如氨基酸、生物胺、甾體和脂肪酸等本身都不具有熒光，因此必須與熒光衍生化試劑反應(yīng)接上能產(chǎn)生熒光的基團(tuán)后才能進(jìn)行熒光檢測。 ? 熒光衍生物的激發(fā)波長和發(fā)射波長往往與試劑本身不同，因此熒光衍生化反應(yīng)既可在柱前也可在桂后進(jìn)行。 ? 熒光衍生物都有紫外吸收，因此也可用紫外檢測，但紫外檢測靈敏度比熒光檢測低 1～ 3個數(shù)量級。 熒光衍生化 ? 上述衍生物的熒光激發(fā)波長范圍為350~370nm， ? 發(fā)射波長范圍為 490～ 540nm，取決于目標(biāo)化合物和測量時使用的溶劑。 ? 由于熒光衍生物的激發(fā)波長和發(fā)射波長與熒光衍生試劑的不同，即使有過量的試劑或有反應(yīng)副產(chǎn)物存在，也不會干擾熒光衍生物的檢測。因此熒光衍生反應(yīng)不需要純化衍生物，可以直接進(jìn)樣。 電化學(xué)衍生化反應(yīng) ? 為什么要電化學(xué)衍生化 ? 液相色譜中的電化學(xué)檢測器靈敏度高、選擇性強(qiáng)，為臨床、生化、食品等樣品的分析提供了新的途徑。 ? 但由于電化學(xué)檢測器只能檢測具有電化學(xué)活性的化合物，如果目標(biāo)化合物沒有電化學(xué)活性就不能被檢測。此時只能與電化學(xué)衍生試劑反應(yīng)，生成具有電化學(xué)活性的衍生物。 ? 電化學(xué)衍生化試劑的特點？ ? 由于 硝基 具有電化學(xué)活性，一系列帶有硝基的衍生化試劑與 羥基、氨基、羧基和羰基 化合物反應(yīng)，可生成電化學(xué)活性的衍生物。 固相化學(xué)衍生化 ? 前面所述的衍生化反應(yīng)都是液 液反應(yīng)的方式，操作起來比較繁瑣、費時，而且需要一些進(jìn)行微量有機(jī)合成的小型裝置。同時，由于反應(yīng)后過量的衍生化試劑存在，對下一步的色譜分析形成干擾，有時還需要進(jìn)行進(jìn)一步的分離。這些都增加了色譜分析的成本和時間。 ? 為了改進(jìn)衍生化方法，使之使用更加方便、快捷，有人 以硅膠或高分子小球為基體 ，在其 表面結(jié)合一種反應(yīng)劑 ，然后填裝在短管內(nèi)，當(dāng)樣品液通過反應(yīng)管時就可以發(fā)生各種化學(xué)反應(yīng)，包括還原、氧化、基團(tuán)轉(zhuǎn)移和催化等。下面分別介紹幾種固相反應(yīng)劑 一般了解 固相化學(xué)衍生化 衍生化反應(yīng)所需設(shè)備 ? 衍生化反應(yīng)處理的樣品往往都是很少量的，一般都是在毫克 (mg)或毫升 (mL)量級，所以使用的設(shè)備都是進(jìn)行微量有機(jī)合成的一些小型裝置 ? 但由于色譜樣品前處理所進(jìn)行的衍生化與一般微量有機(jī)合成又有些差別。衍生化反應(yīng)中的一些特殊要求，決定了進(jìn)行衍生化反應(yīng)操作的某些特點，并導(dǎo)致開發(fā)出一些專用裝置。根據(jù)涉及的反應(yīng)類型不同，可以在各種反應(yīng)試管和容器中或在密閉的安倍瓶中進(jìn)行這些衍生化反應(yīng) ? 因為絕大多數(shù)衍生化反應(yīng)除了要求無水條件外，其他操作條并不需要很嚴(yán)格，所以，衍生化反應(yīng)可以用有各種不同墊片的密封反應(yīng)管瓶。其容積為 1~20mL，并配有各種材料的瓶塞和墊片。反應(yīng)管瓶要能耐受一定壓力， ? 可用微量注射器穿過墊片將樣品和衍生化試劑加到反應(yīng)管瓶中，并同樣可用微量注射器從瓶中取出最終的衍生產(chǎn)物。 ? 衍生化反應(yīng)的加熱可以用恒溫浴或加熱塊加熱，攪拌可用人工或者超聲波振蕩或者用微型電磁攪拌器攪拌。 衍生化反應(yīng)所需設(shè)備及注意事項 衍生化技術(shù)的應(yīng)用 ? 1．用氣相色譜分析有機(jī)羧酸類化合物 ?