雙向電泳的技術(shù)流程和樣品制備-資料下載頁(yè)
2025-03-04 13:26本頁(yè)面
【正文】 金屬染料等。 有機(jī)熒光團(tuán)染料 ? 包括共價(jià)結(jié)合和非共價(jià)結(jié)合的熒光團(tuán)染料兩類 。 后者最為常用 ， 其典型代表是已經(jīng)商品化的 SYPRO Red、 Orange、 Ruby等熒光染料 。 ? 這三種染料可對(duì) SDSPAGE膠內(nèi)蛋白質(zhì)進(jìn)行一步染色 ，約 30~60min完成 ， 靈敏度為 2~10ng。 染色后的凝膠用標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)驗(yàn)室 300nm紫外透射儀進(jìn)行照像保存 ， 其線性范圍為 3個(gè)數(shù)量級(jí) 。 ? 這三種染料的電泳染色結(jié)果與在酵母中通過(guò) SAGE所獲得的基因表達(dá)水平的動(dòng)態(tài)范圍相匹配 。 ? 在 Tris/甘氨酸轉(zhuǎn)印緩沖液中染色后 ， 蛋白質(zhì)可被轉(zhuǎn)印至膜上并進(jìn)行免疫染色或 Edman測(cè)序來(lái)鑒定蛋白質(zhì) 。 金屬螯合染料 ? 這是一類與現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)研究相兼容的 、 相對(duì)較新的蛋白質(zhì)顯色試劑 ， 其設(shè)計(jì)專門與常用微量化學(xué)表征過(guò)程兼容 。 它們不包含戊二醛 、甲醛或 Tween20等 ， 很容易和集成化蛋白質(zhì)組學(xué)平臺(tái) （ 包括自動(dòng)化凝膠染色儀 、 圖像分析工作站 、 機(jī)器人剪切儀器 、 蛋白質(zhì)酶解工作站和質(zhì)譜儀等 ） 相結(jié)合 。 ? 其中 SYPRO Ruby也是一種基于釕的金屬發(fā)光染料 。 凝膠的圖像處理分析和 典型流程 ? 凝膠圖像的掃描： ? 圖像加工： ? 斑點(diǎn)檢測(cè)和定量： ? 凝膠配比： ? 數(shù)據(jù)分析： ? 數(shù)據(jù)呈遞和解釋： ? 2DE數(shù)據(jù)庫(kù)的建立： 蛋白質(zhì)的膠內(nèi)酶切 包括感興趣蛋白點(diǎn)的挖取、含蛋白質(zhì)凝膠的脫色、膠內(nèi)蛋白質(zhì)的酶切等過(guò)程 質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)鑒定的基本流程 樣品制備 與 IPG膠條水化 IPG電泳 與上樣緩沖液浸潤(rùn) SDSPAGE 轉(zhuǎn) PVDF膜 膠內(nèi)直接染色 染色 取出蛋白點(diǎn) 胰酶等消化 濃縮于多孔吸附柱上 MALDIMS肽指紋圖 數(shù)據(jù)庫(kù)查詢 蛋白質(zhì)鑒定 已知 反向 HPLC分離 MALDIMS，PSD片段分析 示知 ESIMSMS、微測(cè)序 實(shí)驗(yàn)方法 完整蛋白質(zhì)（如凝膠分離或色譜純化蛋白質(zhì)） 肽混合物 質(zhì)譜測(cè)定肽質(zhì)量 （ MALDIMS,ESIMS) 選擇肽段裂解 PSDMALDIMS,ESIMS/MS) 計(jì)算方法 蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)庫(kù)（＋核酸序列翻譯數(shù)據(jù)庫(kù)） 肽質(zhì)量檢索： 片 未解析碎片離子檢索：片 酶切 質(zhì)譜鑒定蛋白質(zhì)的策略 體外 pmol [32P]蛋白質(zhì)標(biāo)記 蛋白質(zhì)分離 蛋白酶切 2D磷酸化做圖 ?LCESIMS或 MALDIMS ?LCESIMS ?HPLC IMAC 磷酸化氨基酸分析 體內(nèi) [32P]細(xì)胞標(biāo)記 蛋白酶切 2D磷酸化做圖 相關(guān)分析 磷酸化位點(diǎn)分析策略 ? 非變性 2DPAGE：兩向均在非變性條件下進(jìn)行 ， 這樣分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)的等電點(diǎn)和表觀分子量同生理?xiàng)l件下獲得的這些蛋白的值是一樣的； ? 非變性 /SDS2DPAGE：第一向采用非變性 IEF， 之后在 2%SDS溶液中平衡；第二向也在 SDS存在的條件下進(jìn)行 。 適于分析非共價(jià)鍵連接的蛋白－蛋白間的相互作用 。 ? 非變性 /還原 /SDS2DPAGE：非變性條件下 IEF聚焦 ， 之后用 8M尿素＋ 5%βME＋ 2%SDS進(jìn)行平衡 ， 再進(jìn)行第二 向 SDSPAG電泳 。 此時(shí)分離的蛋白質(zhì)點(diǎn)可進(jìn)行點(diǎn)的切取 、 蛋白酶消化 、MALDITOFMS分析鑒定 ， 提供關(guān)于斷裂二硫鍵連接的多肽的信息 。 ? 變性 2DPAGE：樣品先用 2%SDS＋ 5%βME＋ 95℃ 變性 5min，IEF在 8M尿素＋ 1%NP40條件下進(jìn)行 ， 之后膠條用 2%SDS＋5%βME平衡 ， 然后進(jìn)行 SDSPAGE。 該技術(shù)適于 DNA序列和多肽結(jié)構(gòu)的分析 ， 或分析被碳?xì)滏I連接和其它翻譯后修飾所引起的多肽結(jié)構(gòu)微異質(zhì)性 ， 但此方式顯示的大于 100Kd的蛋白質(zhì)點(diǎn)少于第三種方式 雙向電泳的分類 演講完畢，謝謝觀看！
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