【正文】 。數(shù)據(jù)為次實(shí)驗(yàn)結(jié)果之總和。表 供體細(xì)胞饑餓對綿羊克隆胚胎的早期發(fā)育的影響供體細(xì)胞血清饑餓卵母細(xì)胞數(shù)克隆胚胎的體外發(fā)育數(shù)（）注射融合（）細(xì)胞細(xì)胞桑葚胚囊胚是（）（（）（）（）是（）（）（）（）（）是（）（）（）()()是()()()()()否（）（）（）（）（）新西蘭農(nóng)科院. 通過統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，使用血清饑餓誘導(dǎo)進(jìn)入期的體細(xì)胞經(jīng)過核移植后獲得的?？寺∨咛ピ谝浦埠蟮膽言新屎彤a(chǎn)犢率都明顯提升（圖）[]。圖 同步處理細(xì)胞的?？寺∨咛ヒ浦埠蟀l(fā)育能力和未同步細(xì)胞的?？寺∨咛ヒ浦埠蟀l(fā)育能力的統(tǒng)計(jì)結(jié)果綜合以上結(jié)果，本標(biāo)準(zhǔn)推薦在進(jìn)行體細(xì)胞克隆前，豬和羊的供核體細(xì)胞無需同期化處理，牛的供核體維細(xì)胞需要進(jìn)行同期化處理。(四) 融合與激活方法的選擇在將供體細(xì)胞移入到去核的卵母細(xì)胞的卵周隙之后，并沒有形成完整意義上的重構(gòu)胚胎，還需要將供體細(xì)胞的細(xì)胞核導(dǎo)入到卵母細(xì)胞質(zhì)中，這個(gè)過程稱之為融合。常用的融合方法有滅活的仙臺病毒（）介導(dǎo)的融合和電融合。電融合因其操作簡單，效果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為動物克隆中普遍采用的融合方法。其原理為，瞬間高強(qiáng)度的電流脈沖，可以擊穿細(xì)胞膜，使其通透性發(fā)生改變，從而導(dǎo)致緊密接觸的兩細(xì)胞膜發(fā)生融合。在體細(xì)胞進(jìn)入到卵母細(xì)胞以后，還需要對其進(jìn)行人為的激活來啟動胚胎發(fā)育。在正常受精過程中，精子對卵子的激活作用使得卵母細(xì)胞中游離的鈣離子濃度升高，這被認(rèn)為是卵母細(xì)胞活化的充分必要條件。成熟卵母細(xì)胞中高水平的成熟促進(jìn)因子（）和細(xì)胞靜止因子（）使得卵母細(xì)胞停滯于Ⅱ期，而胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高能夠引發(fā)一系列的磷酸化和去磷酸化事件，最終導(dǎo)致活性降低而使得卵母細(xì)胞從Ⅱ期釋放出來。因此，對于重構(gòu)胚的激活必須通過人為的方法使重構(gòu)胚內(nèi)游離的鈣離子濃度升高。目前常用的激活方法有激活、化學(xué)激活以及電刺激結(jié)合化學(xué)激活三種方法。在這三種方案中，電激活法最為常用，通常將電融合與電刺激同時(shí)進(jìn)行，在電刺激誘導(dǎo)融合的同時(shí)完成激活。例如對于豬的卵母細(xì)胞而言，一個(gè)電脈沖就能夠使卵母細(xì)胞活化，因此在應(yīng)用電脈沖融合重構(gòu)胚時(shí)，便同時(shí)對其進(jìn)行了激活?；瘜W(xué)激活的方法相對于電激活法操作步驟較多，但是有報(bào)道稱化學(xué)激活能夠明顯提高重構(gòu)胚胎發(fā)育率和克隆后代的出生率。另外一些化學(xué)藥品如鈣離子載體、離子霉素（）、放線菌酮（, ）, 二甲基氨基嘌呤（, ）等也常用于卵母細(xì)胞的激活或輔助激活。衛(wèi)恒習(xí)等系統(tǒng)研究了不同電激活參數(shù)和化學(xué)輔助激活方法對豬體細(xì)胞克隆胚胎發(fā)育的影響[]，通過綜合比較，得出電場強(qiáng)度為 ，次脈沖（間隔時(shí)間為 μ），脈沖時(shí)長 μ是最佳的克隆胚胎融合激活參數(shù)（圖）。圖 不同電場強(qiáng)度和脈沖次數(shù)對豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。）不同電場強(qiáng)度下體細(xì)胞克隆胚胎的分裂率（白色），囊胚率（灰色），囊胚細(xì)胞數(shù)（黑色）。）不同脈沖次數(shù)后(白色：次脈沖；灰色：次脈沖)體細(xì)胞克隆胚胎的分裂率、囊胚率以及囊胚細(xì)胞數(shù)。柱子上字母不同代表具有顯著性差異（）[]同時(shí)該研究還發(fā)現(xiàn)電激活后聯(lián)合輔助激活處理能夠顯著提高豬克隆胚胎囊胚率( )，并且其卵裂率和囊胚細(xì)胞數(shù)也有增加的趨勢(圖)．因此，本標(biāo)準(zhǔn)推薦豬的重構(gòu)胚胎使用電場強(qiáng)度為 ，次脈沖（間隔時(shí)間為 μ），脈沖時(shí)長 μ進(jìn)行電融合激活，且電激活后用 處理 進(jìn)行輔助激活。圖 不同激活方法對豬體細(xì)胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響?？寺∨咛サ姆至崖剩ò咨?，囊胚率（灰色），囊胚細(xì)胞數(shù)（黑色）。，電激活。, 電激活聯(lián)合輔助激活。，電激活聯(lián)合輔助激活。柱子上字母不同代表具有顯著性差異（）[]與豬不同，牛是單胎動物，每次可獲得的卵子數(shù)目少，需要移植的胚胎數(shù)量少。因此通常在牛上采取對每個(gè)重構(gòu)胚胎使用微電極進(jìn)行融合，以確保融合率[]。表 使用微電極融合能夠提高克隆胚胎的融合效率電融合方法卵母細(xì)胞數(shù)重構(gòu)胚胎數(shù)融合數(shù)（率）死亡數(shù)率（）微電極 () ()電融合槽 ()()注：經(jīng)檢驗(yàn)，同列中不同字母上標(biāo)代表差異顯著 （ ）。圖 使用微電極(右上)能高效的完成奶山羊和牛重構(gòu)胚的電融合[]。在牛重構(gòu)胚胎制備過程中，只有電融合后的化學(xué)激活法（離子霉素聯(lián)合處理）效果最好且最為常用[]。因此標(biāo)準(zhǔn)推薦使用電刺激同時(shí)進(jìn)行重構(gòu)胚胎的融合與激活[]。表 使用離子霉素和進(jìn)行孤雌激活能夠獲得更高的囊胚率[]激活劑卵裂率囊胚率離子霉素()()()()乙醇()()注：經(jīng)檢驗(yàn)，同列中不同字母上標(biāo)代表差異顯著 （ ）。郭旭東博士在做羊的胚胎融合時(shí)[]選擇了種融合參數(shù)進(jìn)行比較：：在電極之間通以單個(gè)直流脈沖，電壓為 、脈沖時(shí)長 μ；脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個(gè)直流脈沖，電壓為 、脈沖時(shí)長 μ、脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個(gè)直流脈沖，電壓為 、脈沖時(shí)長 μ、脈沖間隔 。結(jié)果如下表所示：表 不同電融合條件下絨山羊重構(gòu)胚融合率的比較融合參數(shù)融合處理卵數(shù)融合成功數(shù)（）死卵數(shù)（） ，單次直流脈沖、 181。次，間隔 （）（） ，兩次直流脈沖、 181。次，間隔 （）（） ，兩次直流脈沖、 181。次，間隔 （）（）注：經(jīng)檢驗(yàn)，同列中不同字母代表差異顯著 （ ）。因?yàn)榻M方案的融合率最高，達(dá)到，因此，本標(biāo)準(zhǔn)推薦羊的重構(gòu)胚胎使用電場強(qiáng)度為 ，次脈沖（間隔時(shí)間為 ），脈沖時(shí)長 μ進(jìn)行電融合，融合后用乙醇進(jìn)行輔助激活。 與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的關(guān)系本標(biāo)準(zhǔn)符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強(qiáng)制性國家標(biāo)準(zhǔn)的要求，本標(biāo)準(zhǔn)的實(shí)施不涉及對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的廢止情況。 標(biāo)準(zhǔn)屬性建議建議將本標(biāo)準(zhǔn)屬性定義為推薦性標(biāo)準(zhǔn)。豬牛羊體細(xì)胞克隆技術(shù)規(guī)范為首次制定和頒布，建議列為推薦性標(biāo)準(zhǔn)較為適宜，今后根據(jù)實(shí)際需要，進(jìn)行不斷的修訂和完善。待本標(biāo)準(zhǔn)實(shí)施后，再根據(jù)需要做適當(dāng)?shù)男抻喓蛷?qiáng)制條款的增加。本標(biāo)準(zhǔn)所附錄均為推薦性的標(biāo)準(zhǔn)，不排除更先進(jìn)和更科學(xué)準(zhǔn)確方法的采用。18 / 18