國家標準豬牛羊體細胞克隆技術(shù)規(guī)范-資料下載頁
2025-04-16 13:16本頁面
【正文】 。數(shù)據(jù)為次實驗結(jié)果之總和。表 供體細胞饑餓對綿羊克隆胚胎的早期發(fā)育的影響供體細胞血清饑餓卵母細胞數(shù)克隆胚胎的體外發(fā)育數(shù)（）注射融合（）細胞細胞桑葚胚囊胚是（）（（）（）（）是（）（）（）（）（）是（）（）（）()()是()()()()()否（）（）（）（）（）新西蘭農(nóng)科院. 通過統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，使用血清饑餓誘導進入期的體細胞經(jīng)過核移植后獲得的?？寺∨咛ピ谝浦埠蟮膽言新屎彤a(chǎn)犢率都明顯提升（圖）[]。圖 同步處理細胞的牛克隆胚胎移植后發(fā)育能力和未同步細胞的?？寺∨咛ヒ浦埠蟀l(fā)育能力的統(tǒng)計結(jié)果綜合以上結(jié)果，本標準推薦在進行體細胞克隆前，豬和羊的供核體細胞無需同期化處理，牛的供核體維細胞需要進行同期化處理。(四) 融合與激活方法的選擇在將供體細胞移入到去核的卵母細胞的卵周隙之后，并沒有形成完整意義上的重構(gòu)胚胎，還需要將供體細胞的細胞核導入到卵母細胞質(zhì)中，這個過程稱之為融合。常用的融合方法有滅活的仙臺病毒（）介導的融合和電融合。電融合因其操作簡單，效果穩(wěn)定的優(yōu)點，已經(jīng)成為動物克隆中普遍采用的融合方法。其原理為，瞬間高強度的電流脈沖，可以擊穿細胞膜，使其通透性發(fā)生改變，從而導致緊密接觸的兩細胞膜發(fā)生融合。在體細胞進入到卵母細胞以后，還需要對其進行人為的激活來啟動胚胎發(fā)育。在正常受精過程中，精子對卵子的激活作用使得卵母細胞中游離的鈣離子濃度升高，這被認為是卵母細胞活化的充分必要條件。成熟卵母細胞中高水平的成熟促進因子（）和細胞靜止因子（）使得卵母細胞停滯于Ⅱ期，而胞質(zhì)內(nèi)鈣離子濃度的升高能夠引發(fā)一系列的磷酸化和去磷酸化事件，最終導致活性降低而使得卵母細胞從Ⅱ期釋放出來。因此，對于重構(gòu)胚的激活必須通過人為的方法使重構(gòu)胚內(nèi)游離的鈣離子濃度升高。目前常用的激活方法有激活、化學激活以及電刺激結(jié)合化學激活三種方法。在這三種方案中，電激活法最為常用，通常將電融合與電刺激同時進行，在電刺激誘導融合的同時完成激活。例如對于豬的卵母細胞而言，一個電脈沖就能夠使卵母細胞活化，因此在應(yīng)用電脈沖融合重構(gòu)胚時，便同時對其進行了激活?；瘜W激活的方法相對于電激活法操作步驟較多，但是有報道稱化學激活能夠明顯提高重構(gòu)胚胎發(fā)育率和克隆后代的出生率。另外一些化學藥品如鈣離子載體、離子霉素（）、放線菌酮（, ）, 二甲基氨基嘌呤（, ）等也常用于卵母細胞的激活或輔助激活。衛(wèi)恒習等系統(tǒng)研究了不同電激活參數(shù)和化學輔助激活方法對豬體細胞克隆胚胎發(fā)育的影響[]，通過綜合比較，得出電場強度為 ，次脈沖（間隔時間為 μ），脈沖時長 μ是最佳的克隆胚胎融合激活參數(shù)（圖）。圖 不同電場強度和脈沖次數(shù)對豬體細胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。）不同電場強度下體細胞克隆胚胎的分裂率（白色），囊胚率（灰色），囊胚細胞數(shù)（黑色）。）不同脈沖次數(shù)后(白色：次脈沖；灰色：次脈沖)體細胞克隆胚胎的分裂率、囊胚率以及囊胚細胞數(shù)。柱子上字母不同代表具有顯著性差異（）[]同時該研究還發(fā)現(xiàn)電激活后聯(lián)合輔助激活處理能夠顯著提高豬克隆胚胎囊胚率( )，并且其卵裂率和囊胚細胞數(shù)也有增加的趨勢(圖)．因此，本標準推薦豬的重構(gòu)胚胎使用電場強度為 ，次脈沖（間隔時間為 μ），脈沖時長 μ進行電融合激活，且電激活后用 處理 進行輔助激活。圖 不同激活方法對豬體細胞克隆胚胎體外發(fā)育能力的影響。克隆胚胎的分裂率（白色），囊胚率（灰色），囊胚細胞數(shù)（黑色）。，電激活。, 電激活聯(lián)合輔助激活。，電激活聯(lián)合輔助激活。柱子上字母不同代表具有顯著性差異（）[]與豬不同，牛是單胎動物，每次可獲得的卵子數(shù)目少，需要移植的胚胎數(shù)量少。因此通常在牛上采取對每個重構(gòu)胚胎使用微電極進行融合，以確保融合率[]。表 使用微電極融合能夠提高克隆胚胎的融合效率電融合方法卵母細胞數(shù)重構(gòu)胚胎數(shù)融合數(shù)（率）死亡數(shù)率（）微電極 () ()電融合槽 ()()注：經(jīng)檢驗，同列中不同字母上標代表差異顯著 （ ）。圖 使用微電極(右上)能高效的完成奶山羊和牛重構(gòu)胚的電融合[]。在牛重構(gòu)胚胎制備過程中，只有電融合后的化學激活法（離子霉素聯(lián)合處理）效果最好且最為常用[]。因此標準推薦使用電刺激同時進行重構(gòu)胚胎的融合與激活[]。表 使用離子霉素和進行孤雌激活能夠獲得更高的囊胚率[]激活劑卵裂率囊胚率離子霉素()()()()乙醇()()注：經(jīng)檢驗，同列中不同字母上標代表差異顯著 （ ）。郭旭東博士在做羊的胚胎融合時[]選擇了種融合參數(shù)進行比較：：在電極之間通以單個直流脈沖，電壓為 、脈沖時長 μ；脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個直流脈沖，電壓為 、脈沖時長 μ、脈沖間隔 ；：在電極之間通以兩個直流脈沖，電壓為 、脈沖時長 μ、脈沖間隔 。結(jié)果如下表所示：表 不同電融合條件下絨山羊重構(gòu)胚融合率的比較融合參數(shù)融合處理卵數(shù)融合成功數(shù)（）死卵數(shù)（） ，單次直流脈沖、 181。次，間隔 （）（） ，兩次直流脈沖、 181。次，間隔 （）（） ，兩次直流脈沖、 181。次，間隔 （）（）注：經(jīng)檢驗，同列中不同字母代表差異顯著 （ ）。因為組方案的融合率最高，達到，因此，本標準推薦羊的重構(gòu)胚胎使用電場強度為 ，次脈沖（間隔時間為 ），脈沖時長 μ進行電融合，融合后用乙醇進行輔助激活。 與有關(guān)的現(xiàn)行法律、法規(guī)和強制性國家標準的關(guān)系本標準符合國家現(xiàn)行法律、法規(guī)、規(guī)章和強制性國家標準的要求，本標準的實施不涉及對現(xiàn)行標準的廢止情況。 標準屬性建議建議將本標準屬性定義為推薦性標準。豬牛羊體細胞克隆技術(shù)規(guī)范為首次制定和頒布，建議列為推薦性標準較為適宜，今后根據(jù)實際需要，進行不斷的修訂和完善。待本標準實施后，再根據(jù)需要做適當?shù)男抻喓蛷娭茥l款的增加。本標準所附錄均為推薦性的標準，不排除更先進和更科學準確方法的采用。18 / 18
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