【正文】 的DNA為模板，催化以引物3’末端為起點的5’→3’DNA鏈延伸反應(yīng)，形成新生DNA鏈。新合成的引物延伸鏈經(jīng)過變性后又可作為下一輪循環(huán)反應(yīng)的模板PCR，就是如此反復(fù)循環(huán)，使目的DNA得到高效快速擴增。1PCR引物設(shè)計的基本要求？答：引物長度一般為15～30個核苷酸。過短影響PCR的特異性，過長會提高相應(yīng)退火溫度，使延伸溫度超過TaqDNA聚合酶最適溫度74℃,影響產(chǎn)物的生成。引物的堿基盡可能隨機，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堿基堆積現(xiàn)象。3’端不應(yīng)有連續(xù)3個G和C。否則會使引物和模板錯誤配對。G+C含量一般占45％ 55％。3’端和5’端引物具有相似的Tm值,Tm值計算公式：Tm＝4(G+C)+ 2(A+T)引物自身不應(yīng)存在互補序列以避免折疊成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。引物的連續(xù)互補序列，一般不超過3bp。兩個引物之間不應(yīng)存在互補序列，尤其應(yīng)避免3’端的互補重疊。引物與非特異擴增區(qū)的序列的同源性不超過70％，引物3’末端連續(xù)8個堿基在待擴增區(qū)以外不能有完全互補序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴增。引物3’端堿基是引發(fā)延伸的起點，因此一定要與模板DNA配對。引物3’端最佳堿基選擇是G和C，形成的堿基配對比較穩(wěn)定。引物與模板結(jié)合時，引物的5’端最多可以游離十幾個堿基而不影響PCR反應(yīng)的進行。引物的5’端可以修飾，如附加限制酶位點，引入突變位點，用生物素、熒光物質(zhì)、地高辛標(biāo)記，加入其它短序列包括起始密碼子、終止密碼子等。？答：天然質(zhì)粒往往存在著缺陷，因而不適合用作基因工程的載體，必須對之進行改造構(gòu)建：a、加入合適的選擇標(biāo)記基因，如兩個以上，易于用作選擇,通常是抗生素基因。b、增加或減少合適的酶切位點，便于重組。c、縮短長度，切去不必要的片段，提高導(dǎo)入效率，增加裝載量。d、改變復(fù)制子，變嚴緊為松弛，變少拷貝為多拷貝。e、根據(jù)基因工程的特殊要求加裝特殊的基因元件答：抗生素抗性篩選、抗性的插入失活、蘭白斑篩選 或PCR篩選、差式篩選、DNA探針過程：多數(shù)克隆載體均帶有抗生素抗性基因（抗氨芐青霉素、四環(huán)素）。當(dāng)質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中后，該菌便獲得抗性，沒有轉(zhuǎn)入的不具有抗性。但不能區(qū)分是否已重組。在含有兩個抗性基因的載體中，如果外源DNA片段插入其中一個基因并導(dǎo)致該基因失活，就可用兩個分別含不同藥物的平板對照篩選陽性重組子。如pUC質(zhì)粒含LacZ基因（編碼β半乳糖苷酶）該酶能分解生色底物Xgal(5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷)產(chǎn)生藍色，從而使菌株變藍。當(dāng)外源DNA插入后，LacZ基因不能表達，菌株呈白色1．參與蛋白質(zhì)生物合成體系的組分有哪些?它們具有什么功能?1答．：蛋白質(zhì)合成的模板；：蛋白質(zhì)合成的氨基酸運載工具；：蛋白質(zhì)合成的場所；：(a)起始因子—參與蛋白質(zhì)合成起始復(fù)合物形成；(b)延長因子—肽鏈的延伸作用；(c)釋放因子一終止肽鏈合成并從核糖體上釋放出來。2．遺傳密碼是如何破譯的?答(1)體外翻譯系統(tǒng)的建立；(2)核糖體結(jié)合技術(shù)；(3)核酸的人工合成。3．遺傳密碼有什么特點?答(1)密碼無標(biāo)點：從起始密碼始到終止密碼止，需連續(xù)閱讀，不可中斷。增加或刪除某個核苷酸會發(fā)生移碼突變。(2)密碼不重疊：組成一個密碼的三個核苷酸只代表一個氨基酸，只使用一次，不重疊使用。(3)密碼的簡并性：在密碼子表中，除Met、Trp各對應(yīng)一個密碼外，其余氨基酸均有兩個以上的密碼，對保持生物遺傳的穩(wěn)定性具有重要意義。(4)變偶假說：密碼的專一性主要由頭兩位堿基決定，第三位堿基重要性不大，因此在與反密碼子的相互作用中具有一定的靈活性。(5)通用性及例外：地球上的一切生物都使用同一套遺傳密碼，但近年來已發(fā)現(xiàn)某些個別例外現(xiàn)象，如某些哺乳動物線粒體中的UGA不是終止密碼而是色氨酸密碼子。(6)起始密碼子AUG，同時也代表Met，終止密碼子UAA、UAG、UGA使用頻率不同。4．簡述三種RNA在蛋白質(zhì)生物合成中的作用。答(1)mRNA：DNA的遺傳信息通過轉(zhuǎn)錄作用傳遞給mRNA，mRNA作為蛋白質(zhì)合成模板，傳遞遺傳信息，指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成。(2)tRNA：蛋白質(zhì)合成中氨基酸運載工具，tRNA的反密碼子與mRNA上的密碼子相互作用，使分子中的遺傳信息轉(zhuǎn)換成蛋白質(zhì)的氨基酸順序是遺傳信息的轉(zhuǎn)換器。(3)rRNA 核糖體的組分，在形成核糖體的結(jié)構(gòu)和功能上起重要作用，它與核糖體中蛋白質(zhì)以及其它輔助因子一起提供了翻譯過程所需的全部酶活性。6．氨基酸在蛋白質(zhì)合成過程中是怎樣被活化的?答催化氨基酸活化的酶稱氨酰tRNA合成酶，形成氨酰tRNA，反應(yīng)分兩步進行：(1)活化 需Mg2+和Mn2+，由ATP供能，由合成酶催化，生成氨基酸AMP酶復(fù)合物。(2)轉(zhuǎn)移 在合成酶催化下將氨基酸從氨基酸—AMP—酶復(fù)合物上轉(zhuǎn)移到相應(yīng)的tRNA上，形成氨酰tRNA。7．簡述蛋白質(zhì)生物合成過程。答蛋白質(zhì)合成可分四個步驟，以大腸桿菌為例：(1)氨基酸的活化：游離的氨基酸必須經(jīng)過活化以獲得能量才能參與蛋白質(zhì)合成，由氨酰tRNA合成酶催化，消耗1分子ATP，形成氨酰tRNA。(2)肽鏈合成的起始：由起始因子參與，mRNA與30S小亞基、50S大亞基及起始甲酰甲硫氨酰tRNA(fMettRNAt)形成70S起始復(fù)合物，整個過程需GTP水解提供能量。(3)肽鏈的延長：起始復(fù)合物形成后肽鏈即開始延長。首先氨酰tRNA結(jié)合到核糖體的A位，然后，由肽酰轉(zhuǎn)移酶催化與P位的起始氨基酸或肽?；纬呻逆I，tRNAf或空載tRNA仍留在P位．最后核糖體沿mRNA5’→3’方向移動一個密碼子距離，A位上的延長一個氨基酸單位的肽酰tRNA轉(zhuǎn)移到P位，全部過程需延伸因子EFTu、EFTs，能量由GTP提供。(4)肽鏈合成終止，當(dāng)核糖體移至終止密碼UAA、UAG或UGA時，終止因子RFRF2識別終止密碼，并使肽酰轉(zhuǎn)移酶活性轉(zhuǎn)為水解作用，將P位肽酰tRNA水解，釋放肽鏈，合成終止。8．蛋白質(zhì)合成中如何保證其翻譯的正確性?答：(1)氨基酸與tRNA的專一結(jié)合，保證了tRNA攜帶正確的氨基酸；(2) 攜帶氨基酸的tRNA對mRNA的識別，mRNA上的密碼子與tRNA上的反密碼子的相互識別，保證了遺傳信息準(zhǔn)確無誤地轉(zhuǎn)譯；(3)起始因子及延長因子的作用，起始因子保證了只有起始氨酰tRNA能進入核糖體P位與起始密碼子結(jié)合，延伸因子的高度專一性，保證了起始tRNA攜帶的fMet不進入肽鏈內(nèi)部；(4)核糖體三位點模型的E位與A位的相互影響，可以防止不正確的氨酰tRNA進入A位，從而提高翻譯的正確性；(5)校正作用：氨酰tRNA合成酶和tRNA的校正作用；對占據(jù)核糖體A位的氨酰tRNA的校對；變異校對即基因內(nèi)校對與基因間校對等多種校正作用可以保證翻譯的正確。9．原核細胞和真核細胞在合成蛋白質(zhì)的起始過程有什么區(qū)別。答1)起始因子不同：原核為IF1，IF2，IF2，真核起始因子達十幾種。(2)起始氨酰tRNA不同：原核為fMettRNAf，真核MettRNAi(3)核糖體不同：原核為70S核粒體，可分為30S和50S兩種亞基，真核為80S核糖體，分40S和60S兩種亞基10．蛋白質(zhì)合成后的加工修飾有哪些內(nèi)容?答：(1)水解修飾；(2)肽鍵中氨基酸殘基側(cè)鏈的修飾；(3)二硫鍵的形成；(4)輔基的連接及亞基的聚合。12．真核細胞與原核細胞核糖體組成有什么不同?如何證明核糖體是蛋白質(zhì)的合成場所?答原核細胞：70S核糖體由30S和50S兩個亞基組成；真核細胞：80S核糖體由40S和60S兩個亞基組成。利用放射性同位素標(biāo)記法，通過核糖體的分離證明之。：僅述真核生物的，原核生物與此相反。（1）.起始Met不需甲酰化；（2）.無SD序列，但需要一個掃描過程；（3）.tRNA先于mRNA與核糖體小亞基結(jié)合；（4）.起始因子比較多；（5）.只一個終止釋放因子。簡述轉(zhuǎn)錄的基本過程?答案要點： 轉(zhuǎn)錄的基本過程包括：模板的識別；轉(zhuǎn)錄起始；通過啟動子；轉(zhuǎn)錄的延伸和終止。.答案要點：起始因子不同；翻譯過程（肽鏈延伸）因子不同；終止因子不同3試比較原核和真核細胞的mRNA的異同.答案要點：‘端有帽子結(jié)構(gòu)大部分成熟沒mRNA 還同時具有3’多聚A尾巴，原核一般沒有； 可以編碼幾個多肽真核只能編碼一個。，UUG作為起始密碼，真核幾乎永遠以AUG作為起始密碼。，真核長。，真核以單順反子形式存在。？轉(zhuǎn)運RNA tRNA 轉(zhuǎn)運氨基酸核蛋白體RNA rRNA 核蛋白體組成成信使RNA mRNA 蛋白質(zhì)合成模板不均一核RNA hnRNA 成熟mRNA的前體小核RNA snRNA 參與hnRNA的剪接小胞漿RNA scRNA/7SLRNA 蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成的信號識別體的組成成分反義RNA anRNA/micRNA 對基因的表達起調(diào)節(jié)作用核 酶 Ribozyme RNA 有酶活性的RNA6簡述tRNA的二級結(jié)構(gòu)特征并指明作用與作用機制。答案要點：1. tRNA攜帶AA，是一種酶促反應(yīng)，也稱AA的活化 氨基酰是tRNA 是AA參與蛋白合成的活化形式。 AA的活化：氨基酸+ATPE 氨基酸AMPE+PPi 每活化一分子AA需消耗ATP的2個高能磷酸鍵。 AA的轉(zhuǎn)移：氨基酸+ AMPE+ tRNA 氨基酸t(yī)RNA+AMP+E氨基酰tRNA合成酶是高度專一性，既能高度特異性識別AA，又能高度特異性識別相應(yīng)，這兩點是保證翻譯準(zhǔn)確進行的基本條件之一。：作為中間產(chǎn)物，利于酶分別對AA和tRNA兩種底物特異辨認，如有錯配，合成酶有校正活性，水解磷酸酯鍵，與正確底物結(jié)合7. 增強子的作用特點答案要點：①增強子提高同一條DNA鏈上基因轉(zhuǎn)錄效率，可以遠距離作用(1－4kb、30kb)，在基因的上游或下游都能起作用。②增強子作用與其序列的正反方向無關(guān)。③增強子與啟動子在結(jié)構(gòu)、功能上密切聯(lián)系，要有啟動子才能發(fā)揮作用,但對啟動子沒有嚴格的專一性，同一增強子可以影響不同類型啟動子的轉(zhuǎn)錄。④增強子的作用機理雖然還不明確，但必須與特定的蛋白質(zhì)因結(jié)合后才能發(fā)揮增強轉(zhuǎn)錄的作用。增強子一般具有組織或細胞特異性，是由這些細胞或組織中具有的特異性蛋白質(zhì)因子所決定的。8. 列舉一個已知的DNA序列編碼一種以上蛋白質(zhì)的三種方法。答案： 給定的一段DNA序列可以以下述方式編碼兩種或兩種以上的蛋白質(zhì)： (1)可讀框中在核糖體結(jié)合位點之后含有多重起始位點； (2)以一兩個堿基的移碼方式出現(xiàn)重疊的可讀框；(3)不同的剪接方式，例如，選擇不同的外顯子組合成不同的mRNA。答： I型內(nèi)含子、II型內(nèi)含子、RnaseP、錘頭型核酶。?答： 35(RNA聚合酶結(jié)合位點)、10(RNA榮合酶起始位點)啟動子序列和終止子；22.(1)如何區(qū)分由啟動子起始轉(zhuǎn)錄的RNA片段與5’端被加工過的RNA片段；答： (1)轉(zhuǎn)錄中，5’核苷三磷酸聚合到RNA鏈的3’0H端，這過程包括釋放焦磷酸（即兩個磷酸基)和形成磷酸二酯鍵。因此，只有5’端第一個核苷酸會有三磷酸基團。若RNA被加工，則5’端的核苷酸會被取代，剩下核苷單磷酸末端。寧可累死在路上，也不能閑死在家里！寧可去碰壁，也不能面壁。是狼就要練好牙，是羊就要練好腿。什么是奮斗？奮斗就是每天很難，可一年一年卻越來越容易。不奮斗就是每天都很容易，可一年一年越來越難。能干的人，不在情緒上計較，只在做事上認真；無能的人！不在做事上認真，只在情緒上計較。拼一個春夏秋冬！贏一個無悔人生！早安！—————獻給所有努力的人.學(xué)習(xí)