【正文】 的 SSB蛋白與單鏈 DNA結(jié)合時(shí)，則不表現(xiàn)上述協(xié)同效應(yīng)。 其中重要的酶與蛋白質(zhì)有： ?SSB蛋白的作用 ? 保證被解鏈酶解開(kāi)的單鏈在復(fù)制完成前能保持單鏈結(jié)構(gòu)，它以四聚體形式存在于復(fù)制叉處，待單鏈復(fù)制后才掉下，重新循環(huán)。 ? 所以， SSB蛋白只保持單鏈的存在，并不能起解鏈的作用。 ? (2)DNA解鏈酶 (DNA helicase)： ? ? DNA解鏈酶能通過(guò)水解 ATP獲得能量來(lái)解開(kāi)雙鏈 DNA。 ? 大部分 DNA解鏈酶 (包括大腸桿菌解鏈酶 Ⅱ 、 Ⅲ 、 T4噬菌體 dda、 T4基因 41和人解鏈酶等 )可沿滯后鏈模板的 5?3?方向并隨著復(fù)制叉的前進(jìn)而移動(dòng)； ? 另一種解鏈酶 (Rep蛋白 )是沿前導(dǎo)鏈模板的 3?539。方向移動(dòng)。因此推測(cè) Rep蛋白和特定 DNA解鏈酶分別在 DNA的兩條母鏈上協(xié)同作用，以解開(kāi)雙鏈 DNA。 ? DNA的解鏈過(guò)程，首先在 拓?fù)洚悩?gòu)酶 I的作用下解開(kāi)負(fù)超螺旋，并與解鏈酶共同作用，在復(fù)制起點(diǎn)處解開(kāi)雙鏈。 ? 參與解鏈的除一組解鏈酶外，還有 Dna蛋白等。一旦局部解開(kāi)雙鏈，就必須有 SSB蛋白 來(lái)穩(wěn)定解開(kāi)的單鏈，以保證該局部結(jié)構(gòu)不會(huì)恢復(fù)成雙鏈。 ? 接著，由 引發(fā)酶 等組成的引發(fā)體迅速作用于兩條單鏈 DNA上。不論是前導(dǎo)鏈還是滯后鏈，都需要一段RNA引物以開(kāi)始子鏈 DNA的合成。 RNA引物的合成 DnaB蛋白活化引物合成酶，引發(fā) RNA引物的合成。 引物長(zhǎng)度約為幾個(gè)至 10個(gè)核苷酸 . 基因組 DNA復(fù)制時(shí)，先導(dǎo)鏈的引物是 DNA，后隨鏈的引物是 RNA () 2022年上海生化與細(xì)胞所 ? 由于 DNA雙螺旋的兩條鏈?zhǔn)欠聪蚱叫械?，因此在?fù)制叉附近解開(kāi)的DNA鏈一條是 5? 3?方向，另一條是 3? 5?方向，兩個(gè)模板極性不同。 ? 所有已知 DNA聚合酶的合成方向都是 5? 3?，這就無(wú)法解釋 DNA的兩條鏈如何能夠同時(shí)進(jìn)行復(fù)制。 ? 為了解釋這一等速?gòu)?fù)制現(xiàn)象，日本學(xué)者 Okazaki等提出了 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 (semidiscontinuous replication)模型。 ?（二）岡崎片段與半不連續(xù)復(fù)制 ? 他用 3H脫氧胸苷短時(shí)間標(biāo)記大腸桿菌，提取 DNA，變性后用超離心方法得到了許多 3H標(biāo)記的 DNA片段 (岡崎片段 )。延長(zhǎng)標(biāo)記時(shí)間后，岡崎片段可轉(zhuǎn)變?yōu)槌墒?DNA鏈，因此這些片段必然是復(fù)制過(guò)程的中間產(chǎn)物。 ? 此外，用 DNA連接酶溫度敏感突變株進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在連接酶不起作用的溫度下，便有大量小 DNA片段累積，說(shuō)明 DNA復(fù)制過(guò)程中至少有一條鏈?zhǔn)紫群铣奢^短的片段，然后再由連接酶連成大分子 DNA。 ? 現(xiàn)在已知一般原核生物的岡崎片段要長(zhǎng)些，真核生物中的要短些。 ? 進(jìn)一步研究還證明，這種前導(dǎo)鏈的連續(xù)復(fù)制和滯后鏈的不連續(xù)復(fù)制在生物界是有普遍性的，因而稱之為 DNA的半不連續(xù)復(fù)制 。 Semidiscontinuous replication Ligation Okazaki fragments ? DNA復(fù)制時(shí)，往往先由 RNA聚合酶在 DNA模板上合成一段 RNA引物 ，再由 DNA聚合酶從 RNA引物 3?端開(kāi)始合成新的 DNA鏈。 ? 對(duì)于前導(dǎo)鏈來(lái)說(shuō)，這一引發(fā)過(guò)程比較簡(jiǎn)單，只要有一段 RNA引物， DNA聚合酶就能以此為起點(diǎn)一直合成下去。 ? 但對(duì)于滯后鏈來(lái)說(shuō)，需要多種蛋白質(zhì)和酶的協(xié)同作用及岡崎片段的形成和連接。 （三） 復(fù)制的引發(fā)和終止 ? 滯后鏈的引發(fā)過(guò)程往往由 引發(fā)體 (Primosome)來(lái)完成。引發(fā)體由 6種蛋白質(zhì) n、 n?、 n??、 DnaB、 C和 I共同組成。只有當(dāng)引發(fā)前體 (preprimosome)把這 6種蛋白質(zhì)合在一起，并與引發(fā)酶 (Primase)進(jìn)一步組裝后形成引發(fā)體，才能發(fā)揮其功效。 ? 引發(fā)體在滯后鏈分叉的方向上前進(jìn)，并在模板上斷斷續(xù)續(xù)地引發(fā)生成滯后鏈的引物 RNA短鏈，再由 DNA聚合酶 III作用合成 DNA，直至遇到下一個(gè)引物或?qū)槠螢橹埂? ? 由 RNase H降解 RNA引物并由 DNA聚合酶 I將缺口補(bǔ)齊，再由 DNA連接酶將兩個(gè)岡崎片段連在一起形成大分子 DNA。 （四）切除 RNA引物，填補(bǔ)缺口，連接相鄰的 DNA片段（復(fù)制終止） 在 RNase H （ DNA聚合酶 Ⅰ ） 催化下切除RNA引物； 留下的空隙由 DNA聚合酶 Ⅰ 催化合成一段DNA填補(bǔ)上； 在 DNA連接酶 作用下，連接相鄰的 DNA鏈。 ? 鏈的終止依賴于 Tus蛋白 參與。 ? 當(dāng)復(fù)制叉前移，遇到 20bp重復(fù)性終止子序列 (Ter)時(shí)， TerTus復(fù)合物能阻擋復(fù)制叉的繼續(xù)前移，等到相反方向的復(fù)制叉到達(dá)后在 DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶 Ⅳ 的作用下使復(fù)制叉解體，釋放子鏈DNA。 （五） DNA聚合酶 ?DNA聚合酶 I: ? 不是復(fù)制大腸桿菌染色體的主要聚合酶 。 ? 有 3?5?核酸外切酶活性，這種活性和聚合酶活性緊密結(jié)合在一起，既可合成 DNA鏈，又能降解 DNA， 保證了 DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性。 ? 它還有 5?3?核酸外切酶的功能，可作用于雙鏈 DNA，又可水解 5?末端或距 5?末端幾個(gè)核苷酸處的磷酸二酯鍵，因而該酶被認(rèn)為在 切除由紫外線照射而形成的嘧啶二聚體 中起著重要的作用。 ? 它也可用以除去岡崎片段 539。端 RNA引物，使岡崎片段間缺口消失，保證連接酶將片段連接起來(lái)。 ? DNA聚合酶 Ⅱ: ? 具有 5?3?方向聚合酶活性，但酶活性很低。只有 DNA聚合酶 I的 5％，故也不是復(fù)制中主要的酶。 ? 其 3?5?核酸外切酶活性可起 校正 作用。 ? 目前認(rèn)為 DNA聚合酶 Ⅱ 的生理功能主要是起 修復(fù) DNA的作用。 ? DNA聚合酶 Ⅲ : ? 含有 7種不同的亞單位和 9個(gè)亞基。其生物活性形式為二聚體。 ? 有 5?3?方向聚合酶活性 ? 有 3?5?核酸外切酶活性。 ? 它的活力較強(qiáng)，為 DNA聚合酶 I的 15倍， DNA聚合酶 Ⅱ 的300倍。 ? 它能在引物的 339。OH上以每分鐘約 5萬(wàn)個(gè)核苷酸的速率延長(zhǎng)新生的 DNA鏈，是大腸桿菌 DNA復(fù)制中鏈延長(zhǎng)反應(yīng)的主導(dǎo)聚合酶。 ? DNA聚合酶 IV和 V： ? 分別由 dinB和 umuD’2C基因編碼 ? 主要在 SOS修復(fù)中發(fā)揮作用。 ? 真核生物 DNA的復(fù)制，每條染色質(zhì)上可以有 多處復(fù)制起始點(diǎn)，而原核生物只有一個(gè)起始點(diǎn)； ? 真核生物的染色體在全部完成復(fù)制之前，各個(gè)起始點(diǎn)上 DNA的復(fù)制不能再開(kāi)始，而在快速生長(zhǎng)的原核生物中，復(fù)制起始點(diǎn)上可以連續(xù)開(kāi)始新的 DNA復(fù)制，表現(xiàn)為雖只有一個(gè)復(fù)制單元，但可有多個(gè)復(fù)制叉。 （六） 真核生物 DNA的復(fù)制特點(diǎn) ? 真核生物 DNA的復(fù)制子被稱為 ARS (autonomously replicating sequences)，長(zhǎng)約 150bp左右，包括幾個(gè)復(fù)制起始必需的保守區(qū)。 ? 真核生物 DNA復(fù)制的起始需要起始原點(diǎn)識(shí)別復(fù)合物 (ORC)參與。 ? 真核生物 DNA復(fù)制叉的移動(dòng)速度大約只有50bp/s，還不到大腸桿菌的 1/20，因此，人類DNA中每隔 30,000－ 300,000bp就有一個(gè)復(fù)制起始位點(diǎn)。 ? 在真核細(xì)胞中主要有 5種 DNA聚合酶 ——DNA聚合酶 α 、 β 、γ 、 δ 和 ε 。 ? DNA聚合酶 α 的功能主要是引物合成。 ? DNA聚合酶 β 活性水平穩(wěn)定，可能主要在 DNA損傷的修復(fù)中起作用。 ? DNA聚合酶 δ 是主要負(fù)責(zé) DNA復(fù)制的酶，參與先導(dǎo)鏈和滯后鏈的合成。 ? DNA聚合酶 ε 的主要功能可能是在去掉 RNA引物后把缺口補(bǔ)全。 （七） DNA復(fù)制的調(diào)控 ? 原核細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖速度取決于培養(yǎng)條件，但在生長(zhǎng)、增殖速度不同的細(xì)胞中 DNA鏈延伸的速度幾乎是恒定的，只是復(fù)制叉的數(shù)量不同。 ? 迅速分裂的細(xì)胞具較多復(fù)制叉，而分裂緩慢的細(xì)胞復(fù)制叉較少并出現(xiàn)復(fù)制的間隙。 ? 細(xì)胞內(nèi)復(fù)制叉的多少?zèng)Q定了復(fù)制起始頻率的高低，這可能是原核細(xì)胞復(fù)制的調(diào)控機(jī)制。復(fù)制起始頻率的直接調(diào)控因子是蛋白質(zhì)和 RNA。 1 大腸桿菌染色體 DNA的復(fù)制調(diào)控 ? 染色體的復(fù)制與細(xì)胞分裂一般是同步的，但復(fù)制與細(xì)胞分裂并不直接偶聯(lián)。 ? 復(fù)制起始不依賴于細(xì)胞分裂，而復(fù)制的終止則能引發(fā)細(xì)胞分裂。 ? 在一定生長(zhǎng)速度范圍內(nèi)，細(xì)胞與染色體的質(zhì)量之比相對(duì)恒定，這是由活化物、阻遏物和去阻遏物及它們的相互作用所制約的。 2 ColE I質(zhì)粒 DNA的復(fù)制調(diào)控 ? ColE I是一個(gè) 6646bp的小質(zhì)粒，在宿主細(xì)胞內(nèi)拷貝數(shù)為 2030。 ColE l DNA復(fù)制不依賴于其本身編碼的蛋白質(zhì)，而完全依靠宿主 DNA聚合酶。質(zhì)粒 DNA編碼兩個(gè)負(fù)調(diào)控因子 Rop蛋白 和 反義 RNA(RNA1)，它們控制了起始 DNA復(fù)制所必需的引物合成。 ? 引物 RNA前體的轉(zhuǎn)錄起始于復(fù)制起點(diǎn)上游 555個(gè)核苷酸處，需經(jīng) RNase H加工后產(chǎn)生有 555個(gè)核苷酸的引物，然后由 DNA聚合酶 I在引物的 3?末端起始 DNA合成。 RNA1的編碼區(qū)在引物 RNA編碼區(qū)的 5?末端，轉(zhuǎn)錄方向與引物 RNA相反，因此與引物 RNA的 539。末端互補(bǔ)。 RNA1通過(guò)氫鍵配對(duì)與引物 RNA前體相互作用，阻止了 RNaseH加工引物前體，使其不能轉(zhuǎn)化為有活性的引物而對(duì)復(fù)制起負(fù)調(diào)控作用。 ? RNA1不僅控制質(zhì)粒的拷貝數(shù)而且決定了質(zhì)粒的不相容性。RNA1與引物 RNA分子的相互作用是可逆的，因此細(xì)胞內(nèi) RNA1的濃度決定了 ColEl質(zhì)粒的復(fù)制起始頻率。 ? 另一個(gè)負(fù)調(diào)控因子 Rop蛋白能提高 RNA1與引物前體的相互作用，從而加強(qiáng)了 RNA的負(fù)調(diào)控作用。 3 真核細(xì)胞 DNA的復(fù)制調(diào)控 ? 真核細(xì)胞中 DNA復(fù)制有 3個(gè)水平的調(diào)控： ? (1)細(xì)胞生活周期水平調(diào)控 ? 即限制點(diǎn)調(diào)控，即決定細(xì)胞停留在 G1期還是進(jìn)入 S期。 ? 許多外部因素和細(xì)胞因子參與限制點(diǎn)調(diào)控。 ? 促細(xì)胞分裂劑、致癌劑、外科切除等都可誘發(fā)細(xì)胞由 G1期進(jìn)入 S期。 ? 一些細(xì)胞質(zhì)因子如四磷酸二腺苷和聚 ADP核糖也可誘導(dǎo) DNA的復(fù)制。 ?(2)染色體水平調(diào)控 ? 決定不同染色體或同一染色體不同部位的復(fù)制子按一定順序在 S期起始復(fù)制。 ? 這種有序復(fù)制的機(jī)理還不清楚。 ?(3)復(fù)制子水平調(diào)控 決定復(fù)制的起始與否 ? 這種調(diào)控從單細(xì)胞生物到高等生物是高度保守的。 ? 此外，真核生物復(fù)制起始還包括 轉(zhuǎn)錄活化 、 復(fù)制起始復(fù)合物的合成 和 引物合成 等階段，許多參與復(fù)制起始蛋白的功能與原核生物中相類似。 ? 酵母染色體復(fù)制只發(fā)生于 S期，各個(gè)復(fù)制子按專一的時(shí)間順序活化，在 S期的不同階段起始復(fù)制 。 ? 研究由 3個(gè)復(fù)制起點(diǎn) (ARS ARS2和 10Z)構(gòu)建的質(zhì)粒發(fā)現(xiàn)，酵母復(fù)制起始受時(shí)序調(diào)控，也受 α 因子和 cdc基因調(diào)控。 ? 已克隆的 ARS片段中都有 14bp的核心序列，其中序列為 A(或 T)TTTATPuTTA(或 T)的 11個(gè)核苷酸是高度保守的，這個(gè)區(qū)域的點(diǎn)突變使 ARS失去復(fù)制起始功能。 五 DNA的修復(fù) 錯(cuò)配修復(fù) 恢復(fù)錯(cuò)配 切除修復(fù)（堿基、核苷酸） 切除突變的堿基和核苷酸片段 重組修復(fù) 復(fù)制后的修復(fù)，重新啟動(dòng)停滯的復(fù)制叉 DNA直接修復(fù) 修復(fù)嘧啶二體或甲基化 DNA SOS系統(tǒng) DNA的修復(fù)，導(dǎo)致變異 大腸桿菌 DNA修復(fù)系統(tǒng) （一） 錯(cuò)配修復(fù) ? 錯(cuò)配修復(fù) (mismatch repair)對(duì) DNA復(fù)制忠實(shí)性的貢獻(xiàn)力達(dá) 102～ 103。 ? DNA子鏈中的錯(cuò)配幾乎完全能被修正，充分反映了母鏈的重要性。 ? 該系統(tǒng)識(shí)別母鏈的依據(jù)來(lái)自 Dam甲基化酶 ，它能使位于 5?GATC序列中腺苷酸的 N6位甲基化。一旦復(fù)制叉通過(guò)復(fù)制起始位點(diǎn)，母鏈就會(huì)在開(kāi)始 DNA合成前的幾秒鐘至幾分鐘內(nèi)被甲基化。 ? 此后，只要兩條 DNA鏈上堿基配對(duì)出現(xiàn)錯(cuò)誤，錯(cuò)配修復(fù)系統(tǒng)就會(huì)根據(jù) “ 保存母鏈，修正子鏈 ” 的原則，找出錯(cuò)誤堿基所在的 DNA鏈，并在對(duì)應(yīng)于母鏈甲基化腺苷酸上游鳥苷酸的539。位置切開(kāi)子鏈，再根據(jù)錯(cuò)配堿基相對(duì)于 DNA切口的方位修復(fù)，合成新的子鏈片段