【正文】 ），輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣在吸水紙上1min，真空抽干至無(wú)乙醇味道。加入9ulDEPC處理的滅菌去離子水和1ulRNA酶抑制劑，混勻溶解。RTPCR、1ulTaqDNA聚合酶、2ul提取的樣品RNA（陽(yáng)性對(duì)照取1ul陽(yáng)性對(duì)照RNA和1ul溶液X）于PCR管中，混勻后做好標(biāo)記，在PCR儀中進(jìn)行如下循環(huán)：42℃45min，94℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸7min。電泳觀察結(jié)果： 1倍稀釋的電泳緩沖液中，于微波爐中熔解，加入10ul溴化乙錠混勻。在電泳槽中放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，凝固后將梳子取出，將擴(kuò)增產(chǎn)物10ul混合1ul上樣緩沖液，點(diǎn)樣于上樣孔中，以80120V電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)545bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)照擴(kuò)增帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，試驗(yàn)樣品出現(xiàn)545bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒陽(yáng)性，否則為陰性。禽流感病毒H7亞型RTPCR檢測(cè)方法用途：禽流感病毒H7亞型反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR），用于檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物中H7亞型禽流感病毒，適用于禽流感病毒H7亞型的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理：利用異硫氰酸胍方法提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異性DNA片段的基因拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35個(gè)循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。該方法可以檢測(cè)H7亞型禽流感病毒。試劑RNA提取試劑：變性液、醋酸鈉溶液、酚/氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理的滅菌去離子水、RNA酶抑制劑，陽(yáng)性對(duì)照。RTPCR反應(yīng)試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RTPCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、礦物油。電泳試劑：50倍TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、上樣緩沖液、滅菌去離子水 器材儀器：分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像系統(tǒng)、液氮或70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20ml一次性注射器、（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10ul、200ul、1000ul）、電泳級(jí)瓊脂糖、量筒、錐形瓶、滅菌雙蒸水。 樣品樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，放入50%甘油生理鹽水中。(2～8℃)保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料）樣品處理：每份樣品分別處理。組織樣品的處理：，（）繼續(xù)研磨，取已經(jīng)研磨好的待檢組織液，8000rpm離心2min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混勻。血清樣品的處理：取血清100ul，加入300ul消化液，混勻。陰陽(yáng)性對(duì)照處理：取陰性/陽(yáng)性對(duì)照100ul，加入300ul消化液，混勻。RNA提取：處理好的樣品，每管依次加入醋酸鈉溶液30ul，酚/氯仿/異戊醇混合液300ul，顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃12000rpm離心15min。，加入300ul異丙醇，混勻，置液氮3min或70℃30min，室溫融化，4℃15000rpm離心20min。棄去上清，沿管壁緩緩加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣在吸水紙上1min，真空抽干至無(wú)乙醇味道。加入9ulDEPC處理的滅菌去離子水和1ulRNA酶抑制劑，混勻溶解。RTPCR、1ulTaqDNA聚合酶、2ul提取的樣品RNA（陽(yáng)性對(duì)照取1ul陽(yáng)性對(duì)照RNA和1ul溶液X）于PCR管中，混勻后做好標(biāo)記，在PCR儀中進(jìn)行如下循環(huán)：42℃45min，95℃3min；95℃30sec，50℃40sec，72℃40sec，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。電泳觀察結(jié)果： 1倍稀釋的電泳緩沖液中，于微波爐中熔解，加入10ul溴化乙錠混勻。在電泳槽中放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，凝固后將梳子取出，將擴(kuò)增產(chǎn)物10ul混合1ul上樣緩沖液，點(diǎn)樣于上樣孔中，以80120V電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)633bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)照擴(kuò)增帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，試驗(yàn)樣品出現(xiàn)633bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒陽(yáng)性，否則為陰性。禽流感病毒H9亞型RTPCR檢測(cè)方法用途：禽流感病毒H9亞型反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR），用于檢測(cè)禽組織、分泌物、排泄物中H9亞型禽流感病毒，適用于禽流感病毒H9亞型的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理：利用異硫氰酸胍方法提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異性DNA片段的基因拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35個(gè)循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。該方法可以檢測(cè)H9亞型禽流感病毒。試劑RNA提取試劑：變性液、醋酸鈉溶液、酚/氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理的滅菌去離子水、RNA酶抑制劑，陽(yáng)性對(duì)照。RTPCR反應(yīng)試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RTPCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、礦物油。電泳試劑：50倍TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、上樣緩沖液、滅菌去離子水 器材儀器：分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像系統(tǒng)、液氮或70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20ml一次性注射器、（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10ul、200ul、1000ul）、電泳級(jí)瓊脂糖、量筒、錐形瓶、滅菌雙蒸水。 樣品樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物或排泄物，放入50%甘油生理鹽水中。(2～8℃)保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料）樣品處理：每份樣品分別處理。組織樣品的處理：，（）繼續(xù)研磨，取已經(jīng)研磨好的待檢組織液，8000rpm離心2min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混勻。血清樣品的處理：取血清100ul，加入300ul消化液，混勻。陰陽(yáng)性對(duì)照處理：取陰性/陽(yáng)性對(duì)照100ul，加入300ul消化液，混勻。RNA提?。禾幚砗玫臉悠?，每管依次加入醋酸鈉溶液30ul，酚/氯仿/異戊醇混合液300ul，顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃12000rpm離心15min。，加入300ul異丙醇，混勻，置液氮3min或70℃30min，室溫融化，4℃15000rpm離心20min。棄去上清，沿管壁緩緩加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣在吸水紙上1min，真空抽干至無(wú)乙醇味道。加入9ulDEPC處理的滅菌去離子水和1ulRNA酶抑制劑，混勻溶解。RTPCR、1ulTaqDNA聚合酶、2ul提取的樣品RNA（陽(yáng)性對(duì)照取1ul陽(yáng)性對(duì)照RNA和1ul溶液X）于PCR管中，混勻后做好標(biāo)記，在PCR儀中進(jìn)行如下循環(huán)：42℃45min，95℃3min；95℃30sec，50℃30sec，72℃30sec，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10min。電泳觀察結(jié)果： 1倍稀釋的電泳緩沖液中，于微波爐中熔解，加入10ul溴化乙錠混勻。在電泳槽中放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，凝固后將梳子取出，將擴(kuò)增產(chǎn)物10ul混合1ul上樣緩沖液，點(diǎn)樣于上樣孔中，以80120V電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)488bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)照擴(kuò)增帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，試驗(yàn)樣品出現(xiàn)488bp擴(kuò)增帶為禽流感病毒陽(yáng)性，否則為陰性。新城疫病毒RTPCR檢測(cè)方法概況：新城疫（Newcastle Disease,ND）也叫雞瘟或亞洲雞瘟,是由于新城疫病毒（Newcastle Disease Virus,NDV）引起的高度接觸性、傳染性疫病，發(fā)病急，感染率和死亡率高，有時(shí)高達(dá)100%，給養(yǎng)雞業(yè)造成了不可估量的經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)際獸疫局定為A類烈性傳染病，我國(guó)則定為I類烈性傳染病新城疫病原的檢測(cè)：用途：新城疫反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RTPCR），用于檢測(cè)禽血清、組織、分泌物、排泄物中新城疫病毒，適用于新城疫的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。原理：利用異硫氰酸胍方法提取RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以RNA為模板，以引物為起點(diǎn)合成與RNA模板互補(bǔ)的cDNA鏈。在TaqDNA聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延伸的循環(huán)，使特異性DNA片段的基因拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過35個(gè)循環(huán)，最終使基因放大數(shù)百萬(wàn)倍。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳，經(jīng)溴化乙錠染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見DNA片段的擴(kuò)增帶。該方法可以檢測(cè)所有新城疫病毒，但是不能區(qū)分強(qiáng)弱毒。試劑RNA提取試劑：變性液、醋酸鈉溶液、酚/氯仿/異戊醇混合液、異丙醇、75%乙醇、DEPC處理的滅菌去離子水、RNA酶抑制劑，陽(yáng)性對(duì)照。RTPCR反應(yīng)試劑：反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、RTPCR反應(yīng)液、TaqDNA聚合酶、礦物油。電泳試劑：50倍TAE電泳緩沖液、溴化乙錠、上樣緩沖液、滅菌去離子水 器材儀器：分析天平、臺(tái)式冷凍高速離心機(jī)、真空干燥器、制冰機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像系統(tǒng)、液氮或70℃冰箱、微波爐、組織研磨器、20℃冰箱、可調(diào)移液器（2ul、20ul、200ul、1000ul）。耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20ml一次性注射器、（DEPC）水處理的滅菌離心管、吸頭（10ul、200ul、1000ul）、電泳級(jí)瓊脂糖、量筒、錐形瓶、滅菌雙蒸水。 樣品樣品采集：病死或撲殺禽，取肺、脾、腦等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸道分泌物，放入50%甘油生理鹽水中；用注射器取血5～10ml。(2～8℃)保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。（要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融病料）樣品處理：每份樣品分別處理。組織樣品的處理：，（）繼續(xù)研磨，取已經(jīng)研磨好的待檢組織液，8000rpm離心2min，取上清100ul，再加入300ul消化液，混勻。血清樣品的處理：取血清100ul，加入300ul消化液，混勻。陰陽(yáng)性對(duì)照處理：取陰性/陽(yáng)性對(duì)照100ul，加入300ul消化液，混勻。RNA提?。禾幚砗玫臉悠?，每管依次加入醋酸鈉溶液30ul，酚/氯仿/異戊醇混合液300ul，顛倒10次，混勻，冰浴15min，4℃12000rpm離心15min。，加入300ul異丙醇，混勻，置液氮3min或70℃30min，室溫融化，4℃15000rpm離心20min。棄去上清，沿管壁緩緩加入1ml75%乙醇（DEPC水配制），輕輕旋轉(zhuǎn)一周后倒掉，將離心管倒扣在吸水紙上1min，真空抽干至無(wú)乙醇味道。加入9ulDEPC處理的滅菌去離子水和1ulRNA酶抑制劑，混勻溶解。RTPCR、1ulTaqDNA聚合酶、2ul提取的樣品RNA（陽(yáng)性對(duì)照取1ul陽(yáng)性對(duì)照RNA和1ul溶液X）于PCR管中，混勻后做好標(biāo)記，在PCR儀中進(jìn)行如下循環(huán)：42℃45min，95℃3min；94℃30sec，55℃30sec，72℃30sec，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸5min。電泳觀察結(jié)果： 1倍稀釋的電泳緩沖液中，于微波爐中熔解，加入10ul溴化乙錠混勻。在電泳槽中放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，凝固后將梳子取出，將擴(kuò)增產(chǎn)物10ul混合1ul上樣緩沖液，點(diǎn)樣于上樣孔中，以80120V電壓進(jìn)行電泳，30min后在紫外凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)362bp擴(kuò)增帶，陰性對(duì)照無(wú)對(duì)照擴(kuò)增帶（引物帶除外）時(shí)，實(shí)驗(yàn)成立，試驗(yàn)樣品出現(xiàn)362bp擴(kuò)增帶為新城疫病毒陽(yáng)性，否則為陰性。46