【正文】 。夏黎明等 (1998)采用多孔聚酷材料固定里氏木霉 Rut C30 菌絲細(xì)胞，將固定化細(xì)胞在生長限制條件下重復(fù)分批培養(yǎng)，使纖維素酶的合成與玉米秸桿纖維原料的酶解糖化禍合在一個反應(yīng) 器中同時進(jìn)行。在 30℃ 、初始 、搖瓶轉(zhuǎn)速 150r/min 的條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)行 12 次分批培養(yǎng)試驗，每次玉米桿用量為 60g/L，培養(yǎng)周期 ，共 54 組 培養(yǎng)液中含濾紙酶活力平均為 ，還原糖 g/L，糖化率達(dá)到理論值的 %。固定化菌絲形態(tài)正常 。在間歇補(bǔ)料條件下，玉米桿原料的總量可提高， 7d 后還原糖濃 度 達(dá) g/L，糖化率為 %。這種方法將產(chǎn)酶和糖化同時進(jìn)行，工藝簡單、成本低廉、易于連續(xù)自動化操作。陳盛等 (1996)以蟹殼為原料提取殼聚糖，用戊二醛作交聯(lián) 劑，將纖維素酶固定于殼聚糖上，探討了一定量干殼聚糖載體與交聯(lián)劑濃度、給酶量等最適固定化酶條件。 Haapala 等 (1996)利用尼龍網(wǎng)固定化里氏木霉后，其所產(chǎn)的內(nèi) 切 葡聚糖酶和木聚糖酶活性均高于游離菌絲 。當(dāng)以乳糖、纖維素和山梨糖為碳源時，氮源顯著影響這兩種酶活性。 目前國內(nèi)的有關(guān)情況 國內(nèi)的 需求情況 21世紀(jì)被稱為生物技術(shù)的世紀(jì)，國家十分重視生物技術(shù)工程在工農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用。根據(jù)市場調(diào)查和研究分析，纖維素酶的應(yīng)用，不但能夠提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，而且可大大地降低生產(chǎn)成本，該產(chǎn)品的生產(chǎn)彌補(bǔ)了國內(nèi)市場缺口 ，因此具有較大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景。 我國的飼養(yǎng)業(yè)在農(nóng)業(yè)中占舉足輕重的地位，近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對肉、蛋、奶的需求量越來越大，飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，對飼料添加劑的需求量必然會急劇上升。纖維素酶作為飼料添加劑，可使飼料的消化率從 50%60%提高到 80%以上，按我國年產(chǎn)飼料 5000萬噸計，以 1‰的加入量，需求量有 5萬噸以上。在釀酒過程中加入纖維素酶，既提高了產(chǎn)品質(zhì)量，又可提高產(chǎn)量，節(jié)約大量糧食，釀酒業(yè)年需求量在千噸以上。由于紡織業(yè)的發(fā)展和改革，纖維素酶的應(yīng)用也越來越廣泛，僅水洗布生產(chǎn) 一項，國內(nèi)每年需求在 600噸以上。 纖維素酶已廣泛應(yīng)用于棉紡織品（牛仔服、西服等）的水洗整理，可以取代浮石，獲得優(yōu)質(zhì)花斑和懸垂度；纖維素酶還可作為飼料添加酶，增加動物（牛、豬、雞等）的消化代謝功能。此外，該酶制劑還被廣泛用于果汁加工、釀造等領(lǐng)域，市場潛力很大。采用液體深層發(fā)酵工藝（ 30m3 發(fā)酵罐）和固態(tài)發(fā)酵工藝（ 1噸 /天）生產(chǎn)纖維素酶的技術(shù)已通過省級鑒定，現(xiàn)已用于工業(yè)化生產(chǎn)，并獲得了良好經(jīng)濟(jì)效益。經(jīng)噴霧干燥制備的酶粉目前售價 10 萬 /噸，成本約 萬 /噸；經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成的粗酶粉，作為飼料添加酶，目 前售價 3～ 4 萬 /噸，而成本大約 2022～4000 元 /噸，利潤十分豐厚。 主要技術(shù)指標(biāo) 中國礦業(yè)大學(xué) 2022 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 16 頁 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力： CX酶： 4001400u/ml/h 1u相當(dāng)于每小時毫克葡萄糖： C1酶 60230u/ml/(24h) 葡萄糖苷酶 516 u/ml/h Fp 酶： 2054 u/ml/h 產(chǎn)品酶活力：液體 300u/ml，固體 300 u/g 國內(nèi)幾 大生產(chǎn)廠家 廣州裕立寶生物科技有限公司 , 是一家廣州市政府認(rèn)定的高新技術(shù)企業(yè)，從事酶制劑的研發(fā)與生產(chǎn)。 該公司主要生產(chǎn)液態(tài)纖維素酶。 北京盛世嘉明科技開發(fā)有限 公司的前身是北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司銷售公司，北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司是依托中國科學(xué)院微生物研究所和中國食品發(fā)酵研究所的科研力量專門從事科研成果轉(zhuǎn)化的科研 生產(chǎn)型企業(yè)，主要從事酶的生產(chǎn)和應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)與研究。該公司生產(chǎn)食品級纖維素酶，售價為 萬 /噸。 該產(chǎn)品酶活為 10000U/g。 上海三杰生物技術(shù)有限公司主要生產(chǎn)粉狀纖維素酶： 黃褐色冷凍干粉，酶活力 ≥15u/mg ， 15 元 /1 克 ； 黃褐色冷凍干粉，酶活力 ≥300u/mg ， 23 元 /克 。 邢臺市太和生物化學(xué)技術(shù)有限公司主要生產(chǎn)中性 固態(tài)纖維素酶 ，酶活為2022U/g， 萬 /噸。 廣州薈科生物科技有限公司 主要生產(chǎn)液態(tài)纖維素酶， 棕色液體 ， pH 值 在 左右（原液） ，售價為 萬 /噸。 此外還有 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司 ， 上海諾科化工新材料有限公司 ， 東莞寶麗美化工有限公司 ， 湖北立業(yè)生物制品有限公司 ， 廣州伯凱生物技術(shù)有限公司 。 由上面的一些資料可以看出固態(tài)的 酶比液態(tài)的酶要貴。固態(tài)的酶的價格相差也很大，主要看其酶活，酶活越大，價格越高。本設(shè)計生產(chǎn)的酶為固態(tài)的纖維素酶，酶活在 10000U/g.，由上面的價格參考來看可以賣到 10 萬 /噸左右。 本設(shè)計的目的和內(nèi)容 本設(shè)計的目的 纖維素酶幾乎能用于以植物為原料的一切加工業(yè)，在飼料添加劑、紡織業(yè)、石油開采、果蔬加工、發(fā)酵工業(yè)、造紙、中成藥加工等方面有著非常廣泛的用途，特別在飼養(yǎng)、釀酒行業(yè)需求很大，僅水洗布，國內(nèi)每月就需求 5000 噸左右，而且目前國內(nèi)該產(chǎn)品是缺口，每年需大量外匯進(jìn)口。 到目前為止，我國 液體纖維素酶生產(chǎn)廠家較少，產(chǎn)量很小。根據(jù)市場調(diào)查和研究分析，纖維素酶的應(yīng)用，不但能夠提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，而且可大大地降低生產(chǎn)成本，該產(chǎn)品的生產(chǎn)彌補(bǔ)了國內(nèi)市場缺口，因此具有較大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景。預(yù)計在今后的幾年內(nèi)，該產(chǎn)品在國際市場上仍將供不應(yīng)求。 本設(shè)計的主要內(nèi)容 中國礦業(yè)大學(xué) 2022 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 17 頁 本設(shè)計的主要內(nèi)容有：工廠總平面布置、全廠工藝流程設(shè)計、工藝計算、設(shè)備的計算與選型、成本核算；另外，完成設(shè)計圖紙 8 張，有工廠總平面布置圖、工藝流程圖（ 3 張）、發(fā)酵罐設(shè)計圖、 種子罐設(shè)計圖、發(fā)酵車間設(shè)備布置圖（ 2 張 ） 。 中國礦業(yè)大學(xué) 2022 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 18 頁 2 全廠工 藝流程及論證 工藝論證 無菌空氣制備系統(tǒng)工段工藝論證 無菌空氣系統(tǒng)工藝流程 空氣 粗過濾器 儲 氣 一級冷卻 空氣加熱 絲網(wǎng)分離 二級冷卻 旋風(fēng)分離 空氣總過 濾 空氣分過濾 纖維素酶為好氧發(fā)酵生產(chǎn)，需大量空氣。作為氧源，空氣中含有大量各式微生物，會干擾甚至破壞預(yù)定發(fā)酵的正常進(jìn)行。所以，空氣的除菌成為耗氧發(fā)酵工程的一個重要環(huán)節(jié)。“無菌空氣”通常指經(jīng)過除菌過濾后，空氣的含菌量限制在 105內(nèi)。 發(fā)酵工業(yè)工廠所使用的空氣除菌流程隨各地的氣候條件不同而有很大差別。本設(shè)計根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r，采用“兩級冷卻 、 分離 、 加熱”的空氣除菌流程，它可適應(yīng)各種氣候條件，尤其適用于潮濕的地區(qū)，能充分的分離空氣中含有的水分，提高過濾效率。第一次冷卻后空氣中大部分的水和油結(jié)成較大的霧粒析出，由 旋風(fēng)分離器分離。第二冷卻器使空氣進(jìn)一步冷卻，析出一部分較小的霧粒，由絲網(wǎng)分離器分離。通常第一級冷卻到 30— 35℃，第二級冷卻到 20— 25℃除水后相對濕度仍為 100%，須再用加熱的方法將空氣的相對濕度降至 40%— 50%，再通過空氣過濾器過濾除菌。 1）采風(fēng)： 采風(fēng)口設(shè)在離地面 10m以上，以保證采到較潔凈的空氣，空氣含菌量保 持在103— 104之間。 2）高效前置過濾： 利用壓縮機(jī)的抽吸作用，使空氣經(jīng)高效過濾后，進(jìn)入壓縮空氣機(jī)，無菌程度高。 3）空氣壓縮： 一般工廠選用往復(fù)式空氣壓縮機(jī)供氣，但它的運轉(zhuǎn)使空 氣帶進(jìn)油霧，導(dǎo)致傳熱面的油膜影響，降低空氣的給熱系數(shù)，給空氣冷卻帶來困難。雖然離心式空氣壓縮機(jī)和渦輪式空壓機(jī)沒有易損的零部件，沒有潤滑油的污染，但其比較適用于大 中國礦業(yè)大學(xué) 2022 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 19 頁 型發(fā)酵工廠（投資大），由于本廠是中小型工廠設(shè)計，所以采用水冷式無油潤滑的往復(fù)式壓縮機(jī)。 4）空氣貯罐 ： 作用是消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈動，維持穩(wěn)定的空氣壓力，同時也可以利用重力沉降作用分離部分油霧。采用立式貯氣罐。 5）一級冷卻： 經(jīng)過壓縮的空氣溫度很快達(dá)到 120℃。 經(jīng)過一級冷卻，溫度降至 35℃，使大部分的水和油結(jié)成較大的霧粒析出。 6）油水分離： 一級冷卻后，大部分的水和油結(jié)成較大的霧粒析出，由旋風(fēng)分離器分離。 7）二級冷卻： 空氣進(jìn)一步冷卻至 20℃，使部分水分結(jié)成較小的霧粒。 8）油水分離： 第二次冷卻后，析出一部分較小的霧粒，由絲網(wǎng)分離器分離。經(jīng)第二次冷卻，分離后的空氣，油水去除得較為徹底。 9）加熱： 二次冷卻后，空氣的相對濕度仍為 100%。相對濕度較大，通過過濾器時易打濕過濾介質(zhì)使之失效。加熱空氣至 35℃，可以將相對濕度降低至 40%— 50%，保護(hù)過濾介質(zhì)。 10）過濾除菌： 介質(zhì)借助慣性碰撞，截留，沉降，凝聚等作用除去微生物和較小的塵埃顆粒 。 發(fā)酵工段工藝論證 發(fā)酵工藝流程 里氏木霉 斜面培養(yǎng)基 搖瓶培養(yǎng) 種子罐 稻草 洗凈 粉碎 滅菌處理 發(fā)酵罐 國外對纖維素酶的研究有近 40 多年的歷史，纖維素酶產(chǎn)生菌主要有木霉、青霉和曲霉 等，其中里氏木霉被認(rèn)為是最好的纖維素酶產(chǎn)生菌之一。 里氏木霉能用于纖維素酶生產(chǎn)在于其具備如下條件： 1 里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量要高。而且可以通過物理或化學(xué)誘變獲取高產(chǎn)菌株； 2 里氏木霉容易培養(yǎng)和控 中國礦業(yè)大學(xué) 2022 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 20 頁 制。里氏木霉要求的生長環(huán)境粗放，適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理； 3 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性好。在通常的生產(chǎn)條件下，能夠穩(wěn)定的用于生產(chǎn)，不宜退化； 4 里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶容易分離純化。其產(chǎn)生的纖維素酶是胞外酶，發(fā)酵完成后，纖維素酶容易與菌體分離純化得到所需的酶； 5 里氏木霉及其代謝物安全無毒，不會影響生產(chǎn)人員和環(huán)境，也不 會對纖維素酶的生產(chǎn)造成不良影響。 綜上，在本設(shè)計中我選擇里氏木霉作為生產(chǎn)菌種。 斜面培養(yǎng)基 土豆 PDA 斜面 , 30 ℃培養(yǎng) 6 d 后使用。 種子培養(yǎng)基 (質(zhì)量分?jǐn)?shù) ,%) 麩皮 2 葡萄糖 3 (NH4)2SO4 發(fā)酵培養(yǎng)基 (質(zhì)量分?jǐn)?shù) ,%):稻草粉 6 豆餅粉 1 ,KH? PO? , CaCl? , 生產(chǎn)方法 纖維素酶的生產(chǎn)可采用固體培養(yǎng)和液體深層培養(yǎng)兩種方法。固體培養(yǎng)設(shè)備比較簡單，易于推廣，但容易污染雜菌 。而液體深層培養(yǎng)的方法易于控制，不易染雜菌，生產(chǎn)效 率高，目前生產(chǎn)上常采用液體深層培養(yǎng)法生產(chǎn)纖維素酶。 我國對纖維素酶的研究和生產(chǎn)也已開展了廣泛的研究，大多數(shù)采用固體發(fā)酵。對液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶的研究報道尚不多見，固體發(fā)酵有許多優(yōu)越之處，但發(fā)酵水平不穩(wěn)定，不適于大規(guī)模生產(chǎn)，而液體深層發(fā)酵就改變了這一點。通過分批發(fā)酵或流加發(fā)酵可獲得高活力纖維素酶，最高酶活均以流加發(fā)酵模式取得。流加發(fā)酵已越來越廣泛的應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)和科學(xué)研究，流加發(fā)酵可避免高底物濃度的抑制或分解代謝阻遏，并可獲得最高的菌體濃度，最大的單位體積產(chǎn)率，進(jìn)而降低下游提取的成本。 本設(shè)計選用液體深層發(fā)酵 。 1） 溫度的調(diào)節(jié)控制 溫度是影響細(xì)胞生長繁殖和發(fā)酵產(chǎn)酶的重要因素之一。在不同的發(fā)酵階段，應(yīng)該控制不同的培養(yǎng)溫度。發(fā)酵前期，培養(yǎng)溫度應(yīng)稍高些，以有利于菌體的生長，里氏木霉一般控制前期培養(yǎng)溫度為 30℃ （即最適生長溫度），大約保持 12h；進(jìn)入產(chǎn)酶期后，應(yīng)適當(dāng)降低培養(yǎng)溫度，里氏木霉產(chǎn)酶期培養(yǎng)溫度一般為 28℃ 較低的溫度有利于提高酶的穩(wěn)定性，延長細(xì)胞產(chǎn)酶時間。 2） pH值的調(diào)節(jié) 細(xì)胞產(chǎn)酶的最適 pH值通常接近于酶反應(yīng)的最適 pH值。 pH值應(yīng)控制在 圍內(nèi)，此時產(chǎn)酶量及酶活性較高。 3） 發(fā)酵時間的控制 里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶的發(fā)酵時間一般為 120h。 4） 通氣量的控制 里氏木霉是好氧的霉菌，它的呼吸作用需要耗氧，氧的供應(yīng)不足將影響里氏 中國礦業(yè)大學(xué) 2022 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 21 頁 木霉的生長發(fā)育和纖維素酶的產(chǎn)生。所以，應(yīng)保證發(fā)酵液中一定的溶氧量。發(fā)酵早期，菌體剛剛萌發(fā)，數(shù)量較少，呼吸強(qiáng)度較弱，耗氧速度較低，應(yīng)控制通氣量為 1:；進(jìn)入對數(shù)生長期以后，菌體代謝旺盛，呼吸強(qiáng)度提高，細(xì)胞大量分裂，細(xì)胞濃度迅速增加，因此耗氧速度較快，應(yīng)控制通氣量為 1:1,產(chǎn)酶時期，細(xì)胞分裂完全，細(xì)胞濃度最大，形成大量的酶蛋白，也消耗大量的氧氣，應(yīng)控制 通氣量為1:1。 5） 攪拌速度的控制 攪拌既可以增加發(fā)酵液中的溶氧量，又能保證菌體與培養(yǎng)基的充分接觸，使發(fā)酵過程能順利進(jìn)行。劇烈的攪拌會導(dǎo)致纖維素酶發(fā)