【正文】 相對(duì) 低廉等優(yōu)點(diǎn)。目前國(guó)內(nèi)大部分生產(chǎn)纖維素酶的廠家采用固體發(fā)酵法。然而，固體發(fā)酵有在本質(zhì)上存在著很大的缺陷，不可能像液體深層發(fā)酵那樣隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴(kuò)大而大幅降低生產(chǎn)成本，而且所生產(chǎn)的酶制劑含有雜質(zhì)量很大、產(chǎn)品外觀粗糙、品質(zhì)不穩(wěn)定。王儀明等人 [41]利用麥稈，麩皮等原料通過正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化綠色木霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件，底物減量比發(fā)酵前有所增加。 液體深層發(fā)酵 液體深層發(fā)酵是二十世紀(jì)四十年代提出的概念，國(guó)內(nèi)液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶是將玉米秸稈等粉碎至 20 目以下， 121℃ ， 20min 滅菌處理后送入發(fā)酵罐內(nèi)并且加入產(chǎn)纖維素酶菌種發(fā)酵。從發(fā)酵罐底 的部均勻通入無(wú)菌空氣形成 氣流攪拌。發(fā)酵完的物料經(jīng)壓濾、濃縮、干燥等 一系列 過程得到纖維素酶成品。其工藝流程如圖 所示。 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 11 圖 液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶流程 Fig. The cellulaseproducing process of deep liquid fermentation 液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶消耗的動(dòng)能大、設(shè)備要求高。但是具有原料的利用率高、產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)條件易于控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)物容易提取分離的特點(diǎn) [42]。 纖維素酶的分離純化 纖維素酶是由三種酶復(fù)合而成的，這三種酶分別是內(nèi)切酶、外切酶與 β葡聚糖苷酶，Gerrit [43]等人研究綠色木霉菌的纖維素發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶包括 Endo(Ⅰ ； Ⅱ ； Ⅲ ； Ⅳ ； Ⅴ ； Ⅵ )六種酶；外切酶包括 Exo(Ⅰ ； Ⅱ ； Ⅲ )三種酶； β葡聚糖苷酶只有一種。將綠色木霉菌產(chǎn)生的纖維素酶先經(jīng)過 BioGel P10(100200 mesh) 凝膠色譜柱過濾，再經(jīng)過 DEAEBio Gel A 陰離子交換柱， SEsephadex 陽(yáng)離子交換柱，過程及結(jié)果如圖 所示。 玉米秸稈 發(fā)酵 過濾 產(chǎn)纖維素酶菌種 濃縮 干燥 產(chǎn)品 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 12 圖 纖維素酶的分離純化 Fig. The isolation and purification process of cellulase 纖維素酶的應(yīng)用 纖維素酶作為一種商業(yè)化酶已經(jīng)使用了 30 多年，已經(jīng)成為了工業(yè)上和學(xué)術(shù)上的研究目標(biāo) [44] 在發(fā)酵工業(yè)上的應(yīng)用 隨著啤酒工業(yè)的日益興旺，生產(chǎn)啤酒過程中所形成的啤酒糟對(duì)環(huán)境的污染也日趨嚴(yán)重。當(dāng)前，啤酒糟大多作為飼料和低價(jià)肥料直接出售，但因其含水量較高，很容易霉變，因此不容易儲(chǔ)存，造成環(huán)境的污染與資源浪費(fèi)。用纖維素酶將啤酒糟水解，在適宜的條件可以得到還原糖，其中每干重 100g 啤酒糟可以得到 克的還原糖，還原糖的得率近 11%[45]。還原糖可以進(jìn)一步用于酵母發(fā)酵或生產(chǎn)菌體蛋白，節(jié)約了資源。 在飼料工業(yè)中的應(yīng)用 反芻動(dòng)物飼 料中含有大量的纖維素，反芻動(dòng)物內(nèi)源纖維素酶的不足降低了纖維素的利用率與消化率。因此纖維素酶在飼料工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，其作為一種高效安全的生物催化劑，在反芻動(dòng)物飼料中產(chǎn)生的效果如下 [46]。 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 13 （ 1）提高青貯過程飼料的品質(zhì)。 （ 2）增加反芻動(dòng)物對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高飼料利用消化率。 （ 3）改善反芻動(dòng)物瘤胃的發(fā)酵功能。 （ 4）提高反芻動(dòng)物的產(chǎn)奶量與產(chǎn)奶品質(zhì) 在紡織工業(yè)的應(yīng)用 在紡織工業(yè)上，可將纖維素酶用于石磨水洗、生物拋光、織物減量等方面。纖維素酶目前廣泛用于牛仔服裝類織物的洗滌方面，利用纖維素酶對(duì)纖維素的水解效果，將牛仔服表面腐蝕剝離，從而產(chǎn)生于石磨水洗一樣的效果，例如洗白褪色、染料脫色。經(jīng)過纖維素酶處理過的牛仔服具有很強(qiáng)的立體效果，從而使牛仔服的風(fēng)格獨(dú)特，價(jià)格得到很大提升。 生物拋光就是應(yīng)用纖維素酶將織物表面的細(xì)微纖維水解掉從而得到表面光滑、手感良好、穿著舒適的纖維織物。與傳統(tǒng)的織物處理工藝相比，生物拋光具有很多優(yōu)點(diǎn)，如：穿著時(shí)更加舒適且不易起球、織物表面光潔不易褪色。 經(jīng) 纖維素酶處理過的織物具有柔軟、彈性及可伸縮性等優(yōu)點(diǎn)?？墒箍椢锔虞p柔，減少織物重量，使穿著者更加舒適。研究證明，織物減量率控制在 3%～ 5%，可以使織物更加柔軟并且織物的抗拉力也在允許的范圍內(nèi)。用酸性纖維素酶處理織物，可以有效去除其表面的毛羽等，提高了織物的穿著性 [47]。 在造紙工業(yè)的應(yīng)用 在過去的十年中，纖維素酶在造紙工業(yè)上的應(yīng)用得到了很大發(fā)展 [48]，木質(zhì)原料在處理過程中需要提煉，打磨等過程，消耗了很大能量。使用纖維素酶處理木質(zhì)原料后，可以增加紙品的光潔度、抗拉力、柔韌度等，并且節(jié)約了大約 20%～ 40%的能量 [49]。 在纖維素乙醇開發(fā)利用方面應(yīng)用 據(jù)調(diào)查，纖維素酶在生物燃料生產(chǎn)方面的應(yīng)用可能是最廣泛的 [50]。 當(dāng)今世界，能源問題已經(jīng)成為人類社會(huì)必須面臨的首要問題?；剂系膬?chǔ)量有限再加上人類的無(wú)節(jié)制開發(fā)，化石燃料的枯竭只是時(shí)間問題。因此，必須開發(fā)出一種有效且廉價(jià)的能源代替化石燃料，生物質(zhì)能源是唯一的一種可再生的能源，將生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成液體燃料不僅可以有效替代化石燃料而且可以減少因?yàn)槭褂没剂隙斐傻沫h(huán)境污染問題。利用纖維素酶將木質(zhì)纖維素原料如：甘蔗渣、玉米秸稈、稻草、等糖化 然后利用酵母發(fā)酵得到纖維 素 乙醇 [51]，利用纖維素生產(chǎn)乙醇對(duì)人類社會(huì)的發(fā)展具有劃時(shí)代的意義 [52]，全球各個(gè)國(guó)家正在努力研發(fā)纖維素乙醇。目前，生物乙醇的生產(chǎn)大部分是使用玉米淀粉作為原料高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 14 的，成本較高并且造成了世界糧食儲(chǔ)備的減少，因此研發(fā)高效且廉價(jià)的纖維素酶對(duì)于生產(chǎn)纖維素乙醇具有十分重要的意義。 在其他方面的應(yīng)用 纖維素酶在中草藥有效成分提取等方面也具有很大的潛力。研究證明，用纖維素酶法提取陳皮中的黃酮，產(chǎn)率達(dá)到 %而傳統(tǒng)的化學(xué)提取方法僅有 %。經(jīng)過優(yōu)化的纖維素酶提取方法，其產(chǎn)率可以達(dá)到 %[53]。 木質(zhì)纖維素 木質(zhì)纖維素包括農(nóng)業(yè)廢棄物 (秸稈、莖、殼 )、林業(yè)作物、工業(yè)木材邊角料及廢棄紙品等。木質(zhì)纖維素是一種可再生并且廉價(jià)的豐富資源，僅我國(guó)每年可利用的木質(zhì)纖維素原料總量就可以達(dá)到 20 多億噸，農(nóng)作物秸稈等年產(chǎn)量可以達(dá)到 7 億噸以上，其中稻草（ 19%）、小麥秸稈（ 21%）、玉米秸稈（ 35%）是我國(guó)的三大秸稈資源 [54]。 木質(zhì)纖維素的組成 木質(zhì)纖維素 包括三個(gè)部分 ：纖維素、半纖維素與木質(zhì)素。纖維素分子是一種葡萄糖苷通過 β1 ,4 糖苷鍵連接起來(lái)的鏈狀聚合體，平均聚合度為 85009500，結(jié)晶度高。半纖維素在細(xì)胞壁中位于許多纖維素之間，是由葡萄糖、木糖、甘露糖等聚合而成。半纖維素的分子鏈較短，分支較多，與纖維素相比很容易被水解。木質(zhì)素是在植物界中含量?jī)H次于纖維素重要的有機(jī)高聚物 [55]，它是一類由苯丙烷單元通過碳 碳鍵 與 醚鍵連接的復(fù)雜 并且 無(wú) 一定形態(tài)的高聚物， 木質(zhì)素與半纖維素一起 將 纖維素 包裹起來(lái) 。幾種典型木質(zhì)纖維素原料的組成如表 [56]所示 。 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 15 表 幾種典型木質(zhì)纖維素原料組成及含量 Tab. Composition and content of some typical lignocellulose 原料 纖維素 (%) 半纖維素 (%) 木質(zhì)素 (%) 玉米秸稈 36 28 29 小麥秸稈 36 28 22 稻草 37 19 10 稻殼 36 20 19 軟木 45～ 50 25～ 35 25～ 35 硬木 40～ 55 24～ 40 18～ 25 新聞紙 62 16 21 木質(zhì)纖維素的預(yù)處理 木質(zhì)纖維素由于其結(jié)構(gòu)復(fù)雜、組分構(gòu)成特殊，使其很難直接迅速被纖維素酶降解。為了木質(zhì)纖維素原料綜合利用效果，必須對(duì)其進(jìn)行適當(dāng)?shù)念A(yù)處理。預(yù)處理的結(jié)果應(yīng)該符合以下幾個(gè)條件：（ 1）促進(jìn)糖的生成；（ 2）減少碳水化合物的損失。（ 3）減少抑制水解和發(fā)酵的副產(chǎn)物生成；（ 4）節(jié)約成本 [57]。 預(yù)處理的方法包括化學(xué)法、生物法、物理法、等幾大類 [58]。 目前研究最多的 預(yù)處理 手段是化學(xué)法，包括稀酸處理法、堿或氨處理、有機(jī)溶劑法 、臭氧處理等。 酸處理法通常是用濃度為 1%的硫酸在 106℃ ～ 110℃ 下處理一段時(shí)間，將半纖維素水解成單 糖，降低了纖維素的聚合度 [59]，提高了纖維素酶的可及性。稀酸預(yù)處理后，需將多余的酸中和掉。 堿處理法通常是用濃度為 8%的氫氧化鉀、氫氧化鈣等作用于木質(zhì)纖維素原料。在170℃ 條件，時(shí)間約為 30min。堿處理法使纖維原料，可使原料得到潤(rùn)脹從而內(nèi)表面積增大，纖維素聚合度降低，脫除木質(zhì)素，但是也損失部分半纖維素。 氨處理是將木質(zhì)纖維素原料浸泡在濃度為 10%氨溶液中，時(shí)間為 24～ 48h。此方法可以脫除原料中大部分的木質(zhì)素，并且可以除去抑制后期發(fā)酵的乙?；?，但是在氨濃度較高時(shí)，會(huì)有部分半纖維素的損失。 臭氧可以降解木質(zhì)素與半纖維素，用臭氧處理過的木質(zhì)纖維素可以除掉大約 60%的木質(zhì)素，可以使纖維素底物的酶解速率提高近 5 倍左右，酶解產(chǎn)量可以提高 57%，臭氧處理木質(zhì)纖維素原料有如下諸多優(yōu)點(diǎn)：有效去除木質(zhì)素；不產(chǎn)生有毒物質(zhì)；可以在常溫常壓下進(jìn)行。但由于處理過程中需要消耗大量的臭氧，因此成本較高 [60]。 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 16 有機(jī)溶劑可以 對(duì) 木質(zhì)素與半纖維素之間的連接鍵 起到破壞作用 ，常用的有機(jī)溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮等。在 140℃ 以 溶解。 兩個(gè)典型酸堿處理秸稈條件如下 [61]： （ 1）稀硫酸處理 :用濃度為 %的稀硫酸，處理壓力為 ,時(shí)間為 60min ，固液比為 1： 12 處理秸稈。 （ 2）稀堿處理 :將質(zhì)量相當(dāng)于秸稈 8%的氫氧化鈉溶于水并與粉碎過 60 目的秸稈混合，放入燒杯中，覆蓋以保鮮膜，室內(nèi)放置 30 天。結(jié)果如表 所示 。 表 稀酸與稀堿處理后秸稈各組分含量 Tab. Content of every position pretreated by dilute acid and alkali 預(yù)處理方法 未處理秸稈 稀硫酸預(yù)處理 稀氫氧化鈉預(yù)處理 半纖維素含量 /% 26 14 18 纖維素含量/% 32 18 30 木質(zhì)素含量/% 12 6 4 趙雪冰、劉德華 [62]采用了乙酸脫木質(zhì)素結(jié)合堿脫乙酰基的預(yù)處理工藝（ Acetoline 工藝）對(duì)甘蔗渣進(jìn)行預(yù)處理，提高了甘蔗渣的纖維素酶解性能。 與稀酸處理工藝相比， Acetoine 處理可以得到更高的酶解聚糖轉(zhuǎn)化率。采用正交實(shí)驗(yàn)方法，得到 Acetoline 預(yù)處理甘蔗渣較合適的條件為：采用 80%乙酸， %硫酸， 1：10 固液比在常壓沸點(diǎn)下處理 2h,進(jìn)一步采用相當(dāng)于甘蔗渣重量 4%的氫氧化鈉處理 1h,結(jié)果表 所示 。 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 17 表 采用 Acetoine 工藝處理甘蔗渣結(jié)果 Tab. Result of bagasse pretreated by Acetoine procedure 固體得率（ %） 葡萄糖含量（ %） 木糖含量（ %） 木質(zhì)素含量（ %） 木質(zhì)素脫除率（ %） 乙?；浚?%） 酶解聚糖轉(zhuǎn)化率（ %） 運(yùn)用生物法能夠有效的降解木質(zhì)素，具有能耗低、無(wú)污染、條件溫和等優(yōu)點(diǎn)，常用的菌種是白腐菌，但是白腐菌在降解木質(zhì)素的同時(shí)也部分降解纖維素與半纖維素。 用白腐菌處理秸稈的條件是：將秸稈粉碎過 60 目篩，加入一定量的水， 121℃ 處理20min, 然后接種白腐菌。培養(yǎng)溫度為 30℃ ，時(shí)間為 30 天。結(jié)果如表 所示 [61] 表 白腐菌 處理后秸稈各組分含量 Tab. Every position content of straw pretreated by rot fungi 預(yù)處理方法 未處理秸稈 白腐菌處理 半纖維素含量 /% 26 20 纖維素含量 /% 32 30 木質(zhì)素含量 /% 12 6 物理法主要包括微波法、機(jī)械粉碎法、超聲波法、水壓熱解法和高能輻射法等。 微波法是將木質(zhì)纖維素原料放在密閉容器中進(jìn)行微波處理，溫度維持在 160～180℃ ，糖化效果明顯，但目前該實(shí)驗(yàn)只停留在實(shí)驗(yàn)階段 [63]。 機(jī)械粉碎法能夠破壞半纖維素和木質(zhì)素與纖維素的結(jié)合，降低纖維素的聚合度，增加木質(zhì)纖維素的比表面積。 超聲波法能夠降低纖維素的結(jié)晶度，破壞纖維素分子氫鍵，提高纖維素的反應(yīng)活性 水壓熱解法是將高壓熱水混合纖維原料，使其溶解，此過程中，不需要粉碎原料，不需加酸堿。纖維素原料會(huì)發(fā)生破裂，但該工藝仍處于實(shí)驗(yàn)室研究階段。 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 18 高能輻射法是利用高能