【正文】 相對 低廉等優(yōu)點。目前國內(nèi)大部分生產(chǎn)纖維素酶的廠家采用固體發(fā)酵法。然而，固體發(fā)酵有在本質(zhì)上存在著很大的缺陷，不可能像液體深層發(fā)酵那樣隨著生產(chǎn)規(guī)模的擴大而大幅降低生產(chǎn)成本，而且所生產(chǎn)的酶制劑含有雜質(zhì)量很大、產(chǎn)品外觀粗糙、品質(zhì)不穩(wěn)定。王儀明等人 [41]利用麥稈，麩皮等原料通過正交實驗優(yōu)化綠色木霉菌固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的條件，底物減量比發(fā)酵前有所增加。 液體深層發(fā)酵 液體深層發(fā)酵是二十世紀四十年代提出的概念，國內(nèi)液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶是將玉米秸稈等粉碎至 20 目以下， 121℃ ， 20min 滅菌處理后送入發(fā)酵罐內(nèi)并且加入產(chǎn)纖維素酶菌種發(fā)酵。從發(fā)酵罐底 的部均勻通入無菌空氣形成 氣流攪拌。發(fā)酵完的物料經(jīng)壓濾、濃縮、干燥等 一系列 過程得到纖維素酶成品。其工藝流程如圖 所示。 大連理工大學碩士學位論文 11 圖 液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶流程 Fig. The cellulaseproducing process of deep liquid fermentation 液體深層發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶消耗的動能大、設(shè)備要求高。但是具有原料的利用率高、產(chǎn)量高、周期短、生產(chǎn)條件易于控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、產(chǎn)物容易提取分離的特點 [42]。 纖維素酶的分離純化 纖維素酶是由三種酶復合而成的，這三種酶分別是內(nèi)切酶、外切酶與 β葡聚糖苷酶，Gerrit [43]等人研究綠色木霉菌的纖維素發(fā)現(xiàn)內(nèi)切酶包括 Endo(Ⅰ ； Ⅱ ； Ⅲ ； Ⅳ ； Ⅴ ； Ⅵ )六種酶；外切酶包括 Exo(Ⅰ ； Ⅱ ； Ⅲ )三種酶； β葡聚糖苷酶只有一種。將綠色木霉菌產(chǎn)生的纖維素酶先經(jīng)過 BioGel P10(100200 mesh) 凝膠色譜柱過濾，再經(jīng)過 DEAEBio Gel A 陰離子交換柱， SEsephadex 陽離子交換柱，過程及結(jié)果如圖 所示。 玉米秸稈 發(fā)酵 過濾 產(chǎn)纖維素酶菌種 濃縮 干燥 產(chǎn)品 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 12 圖 纖維素酶的分離純化 Fig. The isolation and purification process of cellulase 纖維素酶的應(yīng)用 纖維素酶作為一種商業(yè)化酶已經(jīng)使用了 30 多年，已經(jīng)成為了工業(yè)上和學術(shù)上的研究目標 [44] 在發(fā)酵工業(yè)上的應(yīng)用 隨著啤酒工業(yè)的日益興旺，生產(chǎn)啤酒過程中所形成的啤酒糟對環(huán)境的污染也日趨嚴重。當前，啤酒糟大多作為飼料和低價肥料直接出售，但因其含水量較高，很容易霉變，因此不容易儲存，造成環(huán)境的污染與資源浪費。用纖維素酶將啤酒糟水解，在適宜的條件可以得到還原糖，其中每干重 100g 啤酒糟可以得到 克的還原糖，還原糖的得率近 11%[45]。還原糖可以進一步用于酵母發(fā)酵或生產(chǎn)菌體蛋白，節(jié)約了資源。 在飼料工業(yè)中的應(yīng)用 反芻動物飼 料中含有大量的纖維素，反芻動物內(nèi)源纖維素酶的不足降低了纖維素的利用率與消化率。因此纖維素酶在飼料工業(yè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，其作為一種高效安全的生物催化劑，在反芻動物飼料中產(chǎn)生的效果如下 [46]。 大連理工大學碩士學位論文 13 （ 1）提高青貯過程飼料的品質(zhì)。 （ 2）增加反芻動物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，提高飼料利用消化率。 （ 3）改善反芻動物瘤胃的發(fā)酵功能。 （ 4）提高反芻動物的產(chǎn)奶量與產(chǎn)奶品質(zhì) 在紡織工業(yè)的應(yīng)用 在紡織工業(yè)上，可將纖維素酶用于石磨水洗、生物拋光、織物減量等方面。纖維素酶目前廣泛用于牛仔服裝類織物的洗滌方面，利用纖維素酶對纖維素的水解效果，將牛仔服表面腐蝕剝離，從而產(chǎn)生于石磨水洗一樣的效果，例如洗白褪色、染料脫色。經(jīng)過纖維素酶處理過的牛仔服具有很強的立體效果，從而使牛仔服的風格獨特，價格得到很大提升。 生物拋光就是應(yīng)用纖維素酶將織物表面的細微纖維水解掉從而得到表面光滑、手感良好、穿著舒適的纖維織物。與傳統(tǒng)的織物處理工藝相比，生物拋光具有很多優(yōu)點，如：穿著時更加舒適且不易起球、織物表面光潔不易褪色。 經(jīng) 纖維素酶處理過的織物具有柔軟、彈性及可伸縮性等優(yōu)點?？墒箍椢锔虞p柔，減少織物重量，使穿著者更加舒適。研究證明，織物減量率控制在 3%～ 5%，可以使織物更加柔軟并且織物的抗拉力也在允許的范圍內(nèi)。用酸性纖維素酶處理織物，可以有效去除其表面的毛羽等，提高了織物的穿著性 [47]。 在造紙工業(yè)的應(yīng)用 在過去的十年中，纖維素酶在造紙工業(yè)上的應(yīng)用得到了很大發(fā)展 [48]，木質(zhì)原料在處理過程中需要提煉，打磨等過程，消耗了很大能量。使用纖維素酶處理木質(zhì)原料后，可以增加紙品的光潔度、抗拉力、柔韌度等，并且節(jié)約了大約 20%～ 40%的能量 [49]。 在纖維素乙醇開發(fā)利用方面應(yīng)用 據(jù)調(diào)查，纖維素酶在生物燃料生產(chǎn)方面的應(yīng)用可能是最廣泛的 [50]。 當今世界，能源問題已經(jīng)成為人類社會必須面臨的首要問題。化石燃料的儲量有限再加上人類的無節(jié)制開發(fā)，化石燃料的枯竭只是時間問題。因此，必須開發(fā)出一種有效且廉價的能源代替化石燃料，生物質(zhì)能源是唯一的一種可再生的能源，將生物質(zhì)資源轉(zhuǎn)化成液體燃料不僅可以有效替代化石燃料而且可以減少因為使用化石燃料而造成的環(huán)境污染問題。利用纖維素酶將木質(zhì)纖維素原料如：甘蔗渣、玉米秸稈、稻草、等糖化 然后利用酵母發(fā)酵得到纖維 素 乙醇 [51]，利用纖維素生產(chǎn)乙醇對人類社會的發(fā)展具有劃時代的意義 [52]，全球各個國家正在努力研發(fā)纖維素乙醇。目前，生物乙醇的生產(chǎn)大部分是使用玉米淀粉作為原料高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 14 的，成本較高并且造成了世界糧食儲備的減少，因此研發(fā)高效且廉價的纖維素酶對于生產(chǎn)纖維素乙醇具有十分重要的意義。 在其他方面的應(yīng)用 纖維素酶在中草藥有效成分提取等方面也具有很大的潛力。研究證明，用纖維素酶法提取陳皮中的黃酮，產(chǎn)率達到 %而傳統(tǒng)的化學提取方法僅有 %。經(jīng)過優(yōu)化的纖維素酶提取方法，其產(chǎn)率可以達到 %[53]。 木質(zhì)纖維素 木質(zhì)纖維素包括農(nóng)業(yè)廢棄物 (秸稈、莖、殼 )、林業(yè)作物、工業(yè)木材邊角料及廢棄紙品等。木質(zhì)纖維素是一種可再生并且廉價的豐富資源，僅我國每年可利用的木質(zhì)纖維素原料總量就可以達到 20 多億噸，農(nóng)作物秸稈等年產(chǎn)量可以達到 7 億噸以上，其中稻草（ 19%）、小麥秸稈（ 21%）、玉米秸稈（ 35%）是我國的三大秸稈資源 [54]。 木質(zhì)纖維素的組成 木質(zhì)纖維素 包括三個部分 ：纖維素、半纖維素與木質(zhì)素。纖維素分子是一種葡萄糖苷通過 β1 ,4 糖苷鍵連接起來的鏈狀聚合體，平均聚合度為 85009500，結(jié)晶度高。半纖維素在細胞壁中位于許多纖維素之間，是由葡萄糖、木糖、甘露糖等聚合而成。半纖維素的分子鏈較短，分支較多，與纖維素相比很容易被水解。木質(zhì)素是在植物界中含量僅次于纖維素重要的有機高聚物 [55]，它是一類由苯丙烷單元通過碳 碳鍵 與 醚鍵連接的復雜 并且 無 一定形態(tài)的高聚物， 木質(zhì)素與半纖維素一起 將 纖維素 包裹起來 。幾種典型木質(zhì)纖維素原料的組成如表 [56]所示 。 大連理工大學碩士學位論文 15 表 幾種典型木質(zhì)纖維素原料組成及含量 Tab. Composition and content of some typical lignocellulose 原料 纖維素 (%) 半纖維素 (%) 木質(zhì)素 (%) 玉米秸稈 36 28 29 小麥秸稈 36 28 22 稻草 37 19 10 稻殼 36 20 19 軟木 45～ 50 25～ 35 25～ 35 硬木 40～ 55 24～ 40 18～ 25 新聞紙 62 16 21 木質(zhì)纖維素的預處理 木質(zhì)纖維素由于其結(jié)構(gòu)復雜、組分構(gòu)成特殊，使其很難直接迅速被纖維素酶降解。為了木質(zhì)纖維素原料綜合利用效果，必須對其進行適當?shù)念A處理。預處理的結(jié)果應(yīng)該符合以下幾個條件：（ 1）促進糖的生成；（ 2）減少碳水化合物的損失。（ 3）減少抑制水解和發(fā)酵的副產(chǎn)物生成；（ 4）節(jié)約成本 [57]。 預處理的方法包括化學法、生物法、物理法、等幾大類 [58]。 目前研究最多的 預處理 手段是化學法，包括稀酸處理法、堿或氨處理、有機溶劑法 、臭氧處理等。 酸處理法通常是用濃度為 1%的硫酸在 106℃ ～ 110℃ 下處理一段時間，將半纖維素水解成單 糖，降低了纖維素的聚合度 [59]，提高了纖維素酶的可及性。稀酸預處理后，需將多余的酸中和掉。 堿處理法通常是用濃度為 8%的氫氧化鉀、氫氧化鈣等作用于木質(zhì)纖維素原料。在170℃ 條件，時間約為 30min。堿處理法使纖維原料，可使原料得到潤脹從而內(nèi)表面積增大，纖維素聚合度降低，脫除木質(zhì)素，但是也損失部分半纖維素。 氨處理是將木質(zhì)纖維素原料浸泡在濃度為 10%氨溶液中，時間為 24～ 48h。此方法可以脫除原料中大部分的木質(zhì)素，并且可以除去抑制后期發(fā)酵的乙酰基，但是在氨濃度較高時，會有部分半纖維素的損失。 臭氧可以降解木質(zhì)素與半纖維素，用臭氧處理過的木質(zhì)纖維素可以除掉大約 60%的木質(zhì)素，可以使纖維素底物的酶解速率提高近 5 倍左右，酶解產(chǎn)量可以提高 57%，臭氧處理木質(zhì)纖維素原料有如下諸多優(yōu)點：有效去除木質(zhì)素；不產(chǎn)生有毒物質(zhì)；可以在常溫常壓下進行。但由于處理過程中需要消耗大量的臭氧，因此成本較高 [60]。 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 16 有機溶劑可以 對 木質(zhì)素與半纖維素之間的連接鍵 起到破壞作用 ，常用的有機溶劑主要有甲醇、乙醇、丙酮等。在 140℃ 以 溶解。 兩個典型酸堿處理秸稈條件如下 [61]： （ 1）稀硫酸處理 :用濃度為 %的稀硫酸，處理壓力為 ,時間為 60min ，固液比為 1： 12 處理秸稈。 （ 2）稀堿處理 :將質(zhì)量相當于秸稈 8%的氫氧化鈉溶于水并與粉碎過 60 目的秸稈混合，放入燒杯中，覆蓋以保鮮膜，室內(nèi)放置 30 天。結(jié)果如表 所示 。 表 稀酸與稀堿處理后秸稈各組分含量 Tab. Content of every position pretreated by dilute acid and alkali 預處理方法 未處理秸稈 稀硫酸預處理 稀氫氧化鈉預處理 半纖維素含量 /% 26 14 18 纖維素含量/% 32 18 30 木質(zhì)素含量/% 12 6 4 趙雪冰、劉德華 [62]采用了乙酸脫木質(zhì)素結(jié)合堿脫乙酰基的預處理工藝（ Acetoline 工藝）對甘蔗渣進行預處理，提高了甘蔗渣的纖維素酶解性能。 與稀酸處理工藝相比， Acetoine 處理可以得到更高的酶解聚糖轉(zhuǎn)化率。采用正交實驗方法，得到 Acetoline 預處理甘蔗渣較合適的條件為：采用 80%乙酸， %硫酸， 1：10 固液比在常壓沸點下處理 2h,進一步采用相當于甘蔗渣重量 4%的氫氧化鈉處理 1h,結(jié)果表 所示 。 大連理工大學碩士學位論文 17 表 采用 Acetoine 工藝處理甘蔗渣結(jié)果 Tab. Result of bagasse pretreated by Acetoine procedure 固體得率（ %） 葡萄糖含量（ %） 木糖含量（ %） 木質(zhì)素含量（ %） 木質(zhì)素脫除率（ %） 乙?；浚?%） 酶解聚糖轉(zhuǎn)化率（ %） 運用生物法能夠有效的降解木質(zhì)素，具有能耗低、無污染、條件溫和等優(yōu)點，常用的菌種是白腐菌，但是白腐菌在降解木質(zhì)素的同時也部分降解纖維素與半纖維素。 用白腐菌處理秸稈的條件是：將秸稈粉碎過 60 目篩，加入一定量的水， 121℃ 處理20min, 然后接種白腐菌。培養(yǎng)溫度為 30℃ ，時間為 30 天。結(jié)果如表 所示 [61] 表 白腐菌 處理后秸稈各組分含量 Tab. Every position content of straw pretreated by rot fungi 預處理方法 未處理秸稈 白腐菌處理 半纖維素含量 /% 26 20 纖維素含量 /% 32 30 木質(zhì)素含量 /% 12 6 物理法主要包括微波法、機械粉碎法、超聲波法、水壓熱解法和高能輻射法等。 微波法是將木質(zhì)纖維素原料放在密閉容器中進行微波處理，溫度維持在 160～180℃ ，糖化效果明顯，但目前該實驗只停留在實驗階段 [63]。 機械粉碎法能夠破壞半纖維素和木質(zhì)素與纖維素的結(jié)合，降低纖維素的聚合度，增加木質(zhì)纖維素的比表面積。 超聲波法能夠降低纖維素的結(jié)晶度，破壞纖維素分子氫鍵，提高纖維素的反應(yīng)活性 水壓熱解法是將高壓熱水混合纖維原料，使其溶解，此過程中，不需要粉碎原料，不需加酸堿。纖維素原料會發(fā)生破裂，但該工藝仍處于實驗室研究階段。 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 18 高能輻射法是利用高能