【正文】 ...... 39 多因素對微生物搖瓶發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響 .................................... 39 發(fā)酵罐實驗條件 .......................................................................................... 40 多因素對微生物上罐發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶活性的影響 ..................................... 40 纖維素酶水解反應(yīng)過程中溫度對酶活力影響 ........................................ 41 高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 VI 纖維素酶水解反應(yīng)過程中 pH 值對酶活力的影響 ................................... 41 纖維素酶的穩(wěn)定性實驗 ......................................................................... 41 實驗結(jié)果與討論 ....................................................................................................... 41 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果 ........................................................................ 41 發(fā)酵時間對纖維素酶活力的影響結(jié)果 ...................................................... 42 不同誘導(dǎo)物對微生物發(fā)酵產(chǎn)纖維素活力酶的影響結(jié)果 ............................. 45 發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 值對 M20 產(chǎn)纖維素酶影響結(jié)果 ............................... 46 發(fā)酵溫度對 M20 產(chǎn)纖維素酶影響結(jié)果 ...................................................... 47 不同的氮源對 M20 產(chǎn)酶活力大小的影響結(jié)果 .......................................... 48 微晶纖維素的添加量對 M20 產(chǎn)纖維素酶活力影響結(jié)果 ........................... 49 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的正交實驗結(jié)果 ................................................................. 50 發(fā)酵時間對發(fā)酵罐實驗 pH 值與 FPA 影響 ................................................ 53 調(diào)控發(fā)酵罐 pH 實驗結(jié)果 ........................................................................... 54 發(fā)酵過程中的補料實驗結(jié)果 ....................................................................... 55 纖維素酶水解反應(yīng)過程中溫度對酶活力影響結(jié)果 ................................... 56 纖維素酶水解反應(yīng)過程中 pH 值對酶活力的影響 .................................... 57 纖維素酶的穩(wěn)定性實驗結(jié)果 ....................................................................... 58 本章小結(jié) ................................................................................................................... 59 4 木質(zhì)纖維素原料的水解 .................................................................................................... 61 引言 ........................................................................................................................... 61 實驗材料與設(shè)備 ........................................................................................................ 61 實驗培養(yǎng)基 .................................................................................................... 61 主要化學(xué)試劑 ................................................................................................ 61 主要實驗儀器 ................................................................................................ 62 實驗方法 ................................................................................................................... 62 木質(zhì)纖維素原料的預(yù)處理 ............................................................................. 62 M20 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 ............................................................................... 62 DNS 法分析 M20 纖維素酶水解落葉與草坪草生成還原糖含量 .............. 63 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 ................................................................................ 63 HPLC 法分析 M20 纖維素酶水解木質(zhì)纖維素原料生成的還原糖 ............ 63 實驗結(jié)果與討論 ....................................................................................................... 63 木質(zhì)纖維素原料預(yù)處理結(jié)果 ........................................................................ 63 M20 發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶的結(jié)果 ........................................................................ 63 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 VII DNS 法分析 M20 纖維素酶水解落葉與草坪草生成還原糖含量結(jié)果 ...... 63 還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制結(jié)果 ........................................................................ 65 HPLC 法分析 M20 纖維素酶水解木質(zhì)纖維素原料生成的還原糖結(jié)果 .... 67 本章小結(jié) ................................................................................................................... 72 結(jié) 論 .................................................................................................................................. 73 展 望 .................................................................................................................................. 74 參 考 文 獻 ............................................................................................................................ 75 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表學(xué)術(shù)論文情況 .................................................................................. 80 致 謝 ........................................................................................................................................ 81 大連理工大學(xué)學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 .............................................................................. 82 大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 1 引 言 隨著世界石油儲備量的逐年減少，國際石油價格的不斷攀升，石油對我國能源安全與經(jīng)濟的可持續(xù)發(fā)展產(chǎn)生了巨大的影響，因為我國石油每年的進口量超過了 億噸，已經(jīng)超過了石油總加工量的一半。 本實驗以大連小平島的海泥樣品、山西秸稈堆積處土壤樣品、拉薩高山日照強烈的土壤樣品為實驗對象，從中篩選出約 10 株能夠產(chǎn)纖維素酶的菌種，經(jīng)過定性與定量測定其纖維素酶活力，選擇其最優(yōu)的纖維素酶生產(chǎn)菌株。同時，因為大量使用化石燃料，環(huán)境污染問題日益嚴(yán)重，全球氣候也受到嚴(yán)重影響。因為纖維素是一種結(jié)構(gòu)致密的化合物，存在很多高能的氫鍵，因此很難被水解利用。在植物細(xì)胞壁中，存在大量的木質(zhì) 素，半纖維素，果膠，單寧，這些物質(zhì)共同組成了天然纖維和其它細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)。 圖 纖維素的分子結(jié)構(gòu) Fig. The molecular structure of cellulose 纖維素酶簡介 1906 年 Seilliere 首次在蝸牛消化液中發(fā)現(xiàn)纖維素酶，纖維素酶的發(fā)現(xiàn)引起了當(dāng)時學(xué)者的廣泛關(guān)注 [13]。其中協(xié)同理論最為廣泛接受[16]。其中以內(nèi)切 —外切酶之間的協(xié)同作用為纖維素酶之間的主要協(xié)同作用方式 [20]。表面活性劑可以增加細(xì)胞膜的通透性，使纖維素酶能夠較快的釋放到細(xì)胞高產(chǎn)纖維素酶菌種的篩選鑒定與發(fā)酵產(chǎn)酶優(yōu)化 6 膜外部。當(dāng)代工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶主要依靠微生物的發(fā)酵完成。真菌中主要有木霉，大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文 9 青霉，曲霉，漆斑霉，根霉，鐮刀霉等。主要有紫外誘變，電磁輻射誘變，亞硝基胍誘變，等離子誘變等。低濃度葡萄糖之所以能夠誘導(dǎo)木霉菌產(chǎn)纖維素酶是因為試劑級別的葡萄糖中含有 %的槐糖 [37]，這是一種二糖，能夠強烈誘導(dǎo)綠色木霉生產(chǎn)纖維素酶，誘導(dǎo)能力是纖維二糖的 2500 倍。 固體發(fā)酵產(chǎn)纖維素酶 固體發(fā)酵（ SSF）是利用含有充分濕度的不容底物發(fā)酵過程，但是不含有足夠的水[40]。其工藝流程如圖 所示。還原糖可以進一步用于酵母發(fā)酵或生產(chǎn)菌體蛋白，節(jié)約了資源。經(jīng)過纖維素酶處理過的牛仔服具有很強的立體效果，從而使牛仔服的風(fēng)格獨特，價格得到很大提升。使用纖維素酶處理木質(zhì)原料后，可以增加紙品的光潔度、抗拉力、柔韌度等，并且節(jié)約了大約 20%～ 40%的能量 [49]。研究證明，用纖維素酶法提取陳皮中的黃酮，產(chǎn)率達(dá)到 %而傳統(tǒng)的化學(xué)提取方法僅有 %。木質(zhì)素是在植物界中含量僅次于纖維素重要的有機高聚物 [55]，它是一類由苯丙烷單元通過碳 碳鍵 與 醚鍵連接的復(fù)雜 并且 無 一定形態(tài)的高聚物， 木質(zhì)素與半纖維素一起 將 纖維素 包裹起來 。 酸處理法通常是用濃度為 1%的硫酸在 106℃ ～ 110℃ 下處理一段時間，將半纖維素水解成單 糖，降低了纖維素的聚合度 [59]，提高了纖維素酶的可及性。但由于處理過程中需要消耗大量的臭氧，因此成本較高 [60]。采用正交實驗方法，得到 Acetoline 預(yù)處理甘蔗渣較合適的條件為：采用 80%乙酸， %硫酸， 1：10 固液比在常壓沸點下處理 2h,進一步采用相當(dāng)于甘蔗渣重量 4%的氫氧化鈉處理 1h,