堿基順序的化學(xué)分析法-資料下載頁
2025-01-16 20:22本頁面
【正文】 端的脫氧核糖 3 ’OH發(fā)生反應(yīng)，形成磷酸二酯鍵而摻入到 DNA鏈中，但它們本身沒有 3 ’OH，不能同后續(xù)的 dNTP形成磷酸二酯鍵，因此，正在延伸的 DNA鏈終止。如果再加入一種一定比例的 ddNTP，則新合成的 DNA在可能摻入正常DNTP的位置都有可能摻入 ddNTP而導(dǎo)致新合成鏈在不同的位置終止。由于競(jìng)爭(zhēng)，因此，產(chǎn)物是一系列長(zhǎng)度不同的多核苷酸片段。這些片段具有共同的起點(diǎn) ——引物的 5 ’端，而有不同的終點(diǎn)，其長(zhǎng)度取決于 ddNTP摻入的位置與引物 5 ’端之間的距離。 原理圖 載體系統(tǒng) ? 具有特殊生活周期的單鏈絲狀噬菌體 M13是Sanger雙脫氧鏈終止法測(cè)序工作的最先選擇。在 M13的生活周期中，既有復(fù)制型雙鏈DNA，又有單鏈 DNA形式。前者可以作為克隆的載體，后者可以作為序列測(cè)定的模板。因此，可以將目的 DNA與 M13RF雙鏈 DNA相連而達(dá)到克隆的目的，然后提取成熟的 M13噬菌體并純化單鏈 DNA作為測(cè)序模板。 M13載體系統(tǒng)用于序列測(cè)定載體有它的優(yōu)點(diǎn)。目前常用的 M13載體為 M13mp18與 M13mp19. M13系統(tǒng) ——單鏈 DNA的序列測(cè)定 ? M13DNA物理圖譜 ? M13/1918圖 M13載體系統(tǒng)的雙脫氧測(cè)定圖 ? 從 M13載體系統(tǒng)的雙脫氧鏈終止法序列測(cè)定 ? 單鏈模板 DNA的制備 ? 雙脫氧測(cè)序反應(yīng) ? 序列膠高壓電泳及放射自顯影 ? DNA序列的閱讀 單鏈模板 DNA 的制備 ? 將待測(cè)目的 DNA插入到 M13載體上的 MCS中，通過轉(zhuǎn)染受體菌獲得重組克隆的噬菌體。 M13感染細(xì)胞后并不使細(xì)胞裂解，但感染的細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，并不斷釋放成熟的噬菌體，一個(gè)細(xì)胞在噬菌體復(fù)制的每一代釋放出 200左右的噬菌體。在液體培養(yǎng)基培養(yǎng)感染細(xì)胞時(shí)，噬菌體不斷從細(xì)胞中釋放出來并在培養(yǎng)基內(nèi)積累。 ? 從單一噬菌斑形成的噬菌體顆粒或從細(xì)菌菌落中小規(guī)模制備單鏈 M13噬菌體或噬菌粒 DNA，常用的方法有 PEG法及乙酸沉淀法。 PEG法制備 M13實(shí)驗(yàn)程序 雙脫氧測(cè)序反應(yīng) 利用 Klenow片段酶的測(cè)序反應(yīng) 一 引物與模板的退火 Klenow片段酶介導(dǎo)的鏈延伸 鏈終止反應(yīng) RT反轉(zhuǎn)錄酶的介導(dǎo)的鏈延伸 鏈終止反應(yīng) 二根據(jù) BRL公司提供程序略加改動(dòng) 準(zhǔn)備工作 ——配制核苷酸貯存液 引物與模板的退火 鏈延伸 鏈終止反應(yīng) 三 以下根據(jù) Boehringer Mannheim公司提供的資料編寫 準(zhǔn)備工作 ——配制 d/ddNTP混合液 引物 模板退火 鏈延伸 終止反應(yīng)
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