【正文】 代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 19 TEM（ TEANAI10 型透射電子顯微鏡， philips） 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)油水比較小時(shí)，得到的粒徑較小，但是形貌不規(guī)則。隨著油水比的增加，粒子逐漸變小，形貌趨于規(guī)則的圓球。這可能是由于油相體積較小，乳化時(shí)殼聚糖溶液無法形成規(guī)則乳滴，造成交聯(lián)固化后的產(chǎn)物不規(guī)則。隨著油相體積增加，油包水乳液的油膜增厚，形成的乳滴較穩(wěn)定，且分散均勻，交聯(lián)固化后的產(chǎn)物呈圓球狀。 圖 不同油相比 納米粒子 的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 shapes (A1) O/W=10:1 (A2) O/W=20:1 (A3) O/W=30: 1 (A4) O/W=40:1 (A5) O/W=50:1 表面活性劑用量對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 25 與圖 是不同油水比對殼聚糖納米粒子粒徑的影響。從表跟圖中可以看出，當(dāng) span80 用量為油相體積的 3%時(shí)，殼聚糖 納米粒子 的粒徑最小。在體系中加入乳化劑是殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 20 為了獲得穩(wěn)定的乳液。乳化劑的加入，可以在油水界面上形成一層界面膜，降低乳滴的表面能，減少 納米粒子 粘連的幾率。乳化劑的用量需要適中，太少 (2%)可能導(dǎo)致界面層太薄，膜強(qiáng)度不夠。隨著乳化劑用量的增加，界面膜厚度和強(qiáng)度逐漸增加，過量會(huì)導(dǎo)致膜層太厚，不容易交聯(lián)，后續(xù)的洗滌也變得困難。結(jié)果表明，控制 span80 的用量為油相體積的 3%可以取得粒徑較小的產(chǎn)物。 表 25 Span80 用量對 納米粒子 的影響 Table 25Effect of Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes No. Percentage Span80(g) Size() PdI B1 2% B2 3% B3 4% B4 5% B5 6% 2% 3% 4% 5%04080120160200240280320360 Size() 圖 不同 Span80 對 納米粒子 影響對比圖 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 21 B 1B 2B 3B 4B 5 圖 不同 Span80 用量 納米粒子 的粒徑分布 Fig. Comparison of different Span80 dosage on nanoparticles39。 sizes (B1) 2% (B2) 3% (B3) 4% (B4) 5% (B5) 6% (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 22 得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)表面活性劑用量較少或較多時(shí)，形成的 納米粒子 性狀不規(guī)則，并且粒徑較大。這可能是由于乳化劑過少或過多造成乳滴界面膜不穩(wěn)定，表面不均勻，存在凹陷，造成在 TEM 成像時(shí)的襯度太低，以致觀察不到物像，故需要磷鎢酸染色。當(dāng)乳化劑用量適中，形成的乳滴分散均勻，交聯(lián)固化后形成的納米粒子 粒徑較小，且分布均勻， TEM 成像時(shí)襯度足夠，故磷鎢酸染色后，仍呈黑色圓球。 綜上， span80 用量為油相體積的 3%時(shí)，殼聚糖納米粒子的粒徑最小，形貌較好，且分布均勻。 圖 不同 Span80 用量納米粒子的 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 shapes of different Span80 dosage (B1) 2% (B2) 3% (B4) 5% 殼聚糖濃度對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 表 26 與圖 是不同殼聚糖濃度對殼聚糖納米粒子粒徑的影響。由表 24 與圖 28可見，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為 10 mg/ml 時(shí)，產(chǎn)物的粒徑達(dá)到了微米級。這可能是由于殼聚糖溶液濃度過低，水相液滴中所含的殼聚糖量極少，乳化分散后與交聯(lián)劑交聯(lián)得到的粒子結(jié)構(gòu)松散，不致密，因此粒徑較大。當(dāng)殼聚糖濃度為 15 mg/mL 時(shí)，產(chǎn)物的粒徑最小，分布性最好。隨著殼聚糖溶液濃度的增加，產(chǎn)物的粒徑也增加，分散性變差，且顏色加深，由白色逐漸變成棕黃色。這可能是由于殼聚糖濃度增加，粘度也隨著增加，殼聚糖間互相粘連使得乳化時(shí)分子較大，最終造成交聯(lián)得到的粒子 粒徑也變大。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 23 表 26 殼聚糖濃度對納米粒子粒徑的影響 Table 26Effect of CS concentration on nanoparticles39。 sizes No. CS(mg/ml) size() PdI C1 10 C2 15 C3 20 C4 25 15 20 2504080120160200240280320 Size(m)m g/ m l 圖 殼聚糖濃度對 納米粒子粒徑的影響 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 sizes 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 24 C 1C 2C 3C 4 圖 不同殼聚糖濃度的 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different CS concentration on nanoparticles39。 sizes (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL (C4) 25 mg/mL (2) TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品后用磷鎢酸進(jìn)行染色，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，殼聚糖溶液濃度過小或過大，得到的產(chǎn)物粒徑均比較大。殼聚糖濃度較小，形成的納米粒子結(jié)構(gòu)松散。殼聚糖濃度較大， 納米粒子 間粘連現(xiàn)象嚴(yán)重，造成產(chǎn)物粒徑大。因此，通過 TEM 圖表明，當(dāng)殼聚糖溶液濃度為15 mg/mL 時(shí)，制備得到的殼聚糖納米粒子粒徑小，形貌好，且分布均勻。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 25 圖 不同殼聚糖濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM images of nanoparticles39。 shapes of different CS concentration (C1) 10 mg/mL (C2) 15 mg/mL (C3) 20 mg/mL 交聯(lián)劑用量對殼聚糖 納米粒子 的影響 (1)粒徑分布及其穩(wěn)定性的分析 從表 27 與圖 可以看出當(dāng)交聯(lián)劑的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不變時(shí)，改變交聯(lián)劑的體積對殼聚糖納米粒子的影響不呈規(guī)律性分布。這可能是由于選擇的交聯(lián)劑質(zhì)量分?jǐn)?shù)適中，在體積較小時(shí)已經(jīng)能夠與殼聚糖交聯(lián)固化，當(dāng)體積增加時(shí)，多余的交聯(lián)劑不參加交聯(lián)。也可能是由于隨著交聯(lián)劑體積的增加，交聯(lián)得到的殼聚糖 納米粒子 結(jié)構(gòu)松散，粒徑分布不均勻，在洗滌過程中，大的粒子聚集沉淀被洗去，剩下粒徑比較小的殼聚糖納米粒子，因此殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的體積無關(guān)。 ①同交聯(lián)劑體積 表 27 交聯(lián)劑 (1 %)體積對 納米粒子 粒徑的影響 Table 27Effect of G dosage on nanoparticles39。 sizes No. Glutaraldehyde aq(1%)/ml Size() PdI D1 2 D2 3 D3 4 D4 5 D5 6 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 26 2 3 4 5 604080120160200240280 Size(m)V / m l 圖 不同交聯(lián)劑體積對 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde volume on nanoparticles39。 sizes ②不同交聯(lián)劑濃度 表 28 與圖 表明，殼聚糖納米粒子的粒徑與交聯(lián)劑的濃度有關(guān)。戊二醛結(jié)構(gòu)中存在著兩個(gè)活潑的醛基，有很高的反應(yīng)活性，易與殼聚糖分子中的自由氨基反應(yīng)，形成交聯(lián)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，交聯(lián)程度小，交聯(lián)效果差。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增 加。 表 28 交聯(lián)劑濃度對納米粒子粒徑的影響 Table 28Effect of G’s concentration on nanoparticles39。 sizes No. Glutaraldehyde aq Size() PdI E1 % E2 1% E3 3% E4 5% E5 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 27 % 1% 3% 5% 7%04080120160200240280320 Size()V / m l 圖 不同交聯(lián)劑濃度對 納米粒子 粒徑 的 影響 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 sizes E 1E 2E 3E 4E 5 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 粒徑分布圖 Fig. Comparison of different glutaraldehyde concentration on nanoparticles39。 sizes (E1) % (E2) 1% (E3) 3% (E4) 5% (E5) 7% 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 28 (2)TEM 分析 TEM 觀察形貌：將樣品分散均勻，用銅網(wǎng)蘸取樣品，以確定所得樣品微粒的大小、形貌和均勻性，并拍攝有代表性的電鏡照片。結(jié)果與納米粒度儀測得的平均粒徑大約相符。從 TEM 圖中可觀察到，當(dāng)交聯(lián)劑濃度較低時(shí)，一開始局部進(jìn)行的是液滴內(nèi)交聯(lián)，隨后隨著交聯(lián)劑體積增加，進(jìn)行液滴間交聯(lián)，因此交聯(lián)得到的產(chǎn)物粒子分布不均勻，交聯(lián)效果差。隨著交聯(lián)劑濃度的增加，交聯(lián)程度增大，交聯(lián)結(jié)構(gòu)緊密。但濃度太大，導(dǎo)致局部濃度過大而使得局部液滴間也進(jìn)行交聯(lián)，造成粒徑分布不均勻，且粒徑增加。綜上，選擇 3 %的戊二醛溶液交聯(lián)時(shí)得到的產(chǎn)物粒徑較小，形貌好，且分布均勻。 圖 不同交聯(lián)劑濃度 納米粒子 TEM 圖 Fig. TEM image of nanoparticles39。 shapes of different glutaraldehyde concentration (E1) % (E3) 3% (E5) 7% 本章小結(jié) 通過以上實(shí)驗(yàn)，表明乳液交聯(lián)法制備殼聚糖納米粒子受到幾個(gè)因素的影響 ——不同油相體系，油水相比例，表面活性劑用量，殼聚糖濃度以及交聯(lián)劑用量。通過各種表征方法分析各因素對殼聚糖 納米粒子 形成的粒徑與形貌的影響。由粒徑分布圖看出，殼聚糖 納米粒子 粒徑與油水相比成反比，與表面活性劑用量成正比，與殼聚糖濃度與成正比，與交聯(lián)劑濃度成正比，與油相體系的粘度成反比。 通過以上實(shí)驗(yàn)， 最終確定制備載藥殼聚糖納米粒子的最佳條件為：殼聚糖濃度為 15 mg/mL, 油水比為 50:1， 表面活性劑為油相體積的 3%，交聯(lián)劑濃度為 3%。 殼聚糖負(fù)載硒代胱氨酸納米粒子的制備及其 體外抗腫瘤活性 的研究 29 第三章 殼聚糖納米粒子負(fù)載硒代胱氨酸的制備 實(shí)驗(yàn)部分 實(shí)驗(yàn)材料 表 31 實(shí)驗(yàn)試劑 Table31 Reagents used in experiment 試劑名稱 規(guī)格 產(chǎn)地 液體石蠟 AR 天津市化學(xué)試劑公司 Span80 CP 天津