【正文】 能 反應(yīng)活性氧類 (reactive oxygen species， ROS) 主要指 O2的單電子還原產(chǎn)物，是一類強氧化劑，包括超 氧陰離子（ O2） 、 羥自由基（ OH） 和 過氧化氫（ H2O2） 及其衍生的 HO2和 單線態(tài)氧（ 1O2 ） 等。 O2 O2 H2O2 OH H2O e e+2H+ e+H+ e+H+ H2O 目 錄 ? 自由基（ free radical）是指任何帶未成對電子的原子、分子或基團。 ? H2O2不是自由基，但在細胞內(nèi) Fe2+或 Cu+的存在下可通過芬頓（ Fenton）或哈伯 韋斯（ HaberWeiss）反應(yīng)轉(zhuǎn)變成羥自由基。 Fe2++H2O2 Fe3++ OH+OH175。 Fenton反應(yīng) HaberWeiss反應(yīng) O2175。 + H2O2 H+ O2+H2O+ OH 目 錄 （一）線粒體呼吸鏈是體內(nèi) ROS的最主要來源 線粒體是 ROS產(chǎn)生的主要部位，又是自由基的主要攻擊靶點。 線粒體內(nèi)產(chǎn)生： （ 1） O2主要在呼吸鏈酶復合體 Ⅰ （ 20％）和復合體 Ⅲ （ 80％）中生成。 （ 2） O2和 H+可能通過反應(yīng)生成 HO2 （ 3）線粒體膜間隙的氧還蛋白 p66，外膜中的 Cyt b5還原酶、單胺氧化酶、二氫乳清酸脫氫酶等也可產(chǎn)生 ROS。 目 錄 * 線粒體外產(chǎn)生 （ 1）微粒體加單氧酶系中 Cyt P450還原酶可產(chǎn)生O2 ； （ 2）細胞過氧化酶體中， FADH2將電子交給 O2生成 H2O2和羥自由基 OH； （ 3）質(zhì)膜的 NADPH氧化酶、胞質(zhì)需氧脫氫酶可催化生成 O2 、 H2O2； （ 4）巨噬細胞、中性粒細胞等受炎癥刺激時可生成 O2和 H2O2， 可殺死細菌； （ 5）外源因素也可導致細胞產(chǎn)生反應(yīng)活性氧類。 目 錄 Fe (Ⅱ ) Fe (III) Fe (IV) Fe (III) Fe (III) Fe (III) e CuB+ O ‖ H+ H2O 微粒體細胞色素 P450基本反應(yīng)機制 Fe (III) AH AH AH AH AH AH AOH Fe (Ⅱ ) AOH e H+ H2O2 2H+ O2175。 AH O2 + 目 錄 1. SOD：超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase) 2O2 175。+ 2H+ SOD H2O2 + O2 H2O + O2 過氧化氫酶 (catalase) 正常細胞內(nèi)， O2水平： 1010~1011 mol/L H2O2水平： 109 mol/L （二）機體抗氧化酶和抗氧化物體系清除活性氧類 目 錄 2. 過氧化氫酶 (catalase) 又稱觸酶，其輔基含 4個血紅素 3. 過氧化物酶 (peroxidase) 以血紅素為輔基，催化 H2O2直接氧化酚類或胺類化合物 2H2O2 2H2O + O2 過氧化氫酶 R + H2O2 RO + H2O RH2+ H2O2 R + 2H2O 過氧化物酶 過氧化物酶 目 錄 谷胱甘肽過氧化物酶 H2O2 (ROOH) H2O (ROH+H2O) 2G –SH G –S – S – G NADP+ NADPH+H+ 谷胱甘肽還原酶 4. 谷胱甘肽過氧化物酶（ glutathione peroxidase），它可消除 H2O2和 ROOH 目 錄 二、細胞微粒體中存在加氧酶類 （一）微粒體細胞色素 P450單加氧酶催化底物分子羥化 RH + NADPH + H+ + O2 ROH + NADP+ + H2O 這類酶催化 O2中的一個氧原子加入底物 (RH)分子，另一個氧原子被 NADPH提供的氫還原成 H2O，又稱為混合功能氧化酶 (mixed function oxidase)或羥化酶 (hydroxylase)。 輔酶 Cyt P450屬于 Cyt b類 ，與 CO結(jié)合后在波長 450nm處出現(xiàn)最大吸收峰，還有 NADPH、黃素蛋白、鐵氧還蛋白參與電子傳遞。 目 錄 目 錄 （二）加雙氧酶 (Dioxygenase)催化向底物雙鍵中加入兩個氧原子 ON H 2NHN HOC O O HN H 2C H O例 如： (O2) 色氨酸吡咯酶 目 錄 第五節(jié) 線粒體功能分析基本原理 Basic Principles of Mitochondrial Function Analyses 目 錄 一、呼吸功能和內(nèi)膜電位等指標評價線粒體氧化還原功能 （一）線粒體呼吸功能 （二）內(nèi)膜電位水平 （三） ATP合酶亞基的表達 目 錄 ? 在一定條件下，加入線粒體后，依次定量加入反應(yīng)底物 (蘋果酸鈉 /L谷氨酸鈉 )、 ADP，用Clark氧電極法等記錄氧耗曲線，觀察線粒體呼吸態(tài)的變化。 ? 3態(tài)呼吸（ ST3）： ADP加入后相應(yīng)氧耗速率。 ? 4態(tài)呼吸（ ST4）： ADP耗盡后相應(yīng)氧耗速率。 ? 呼吸控制率 ( respiratory control rate, RCR)：線粒體呼吸活性以單位線粒體蛋白耗氧表示 (nmol / min mg )，其 4態(tài)耗氧之比(ST3/ST4)表示 RCR。 （一）檢測重要參數(shù)顯示線粒體呼吸功能 目 錄 1. ST3：顯示有呼吸底物時 ADP對氧化磷酸化刺激效應(yīng)，與電子傳遞鏈、 ATP合酶活性相關(guān)。 2. ST4：四態(tài)呼吸時，無 ATP的合成，顯示質(zhì)子漏狀況。 3. RCR反映氧化和磷酸化偶聯(lián)程度。 * ST ST4和 RCR的意義 目 錄 測定方法及原理： 正常的親脂性的陽離子化合物能結(jié)合到線粒體內(nèi)膜。 1. 羅丹明 123 (Rhodamine123)： 可被活細胞線粒體特異攝取，且攝取率與膜電位成正比。 2. 染色劑 JC1： 內(nèi)膜電位依賴性熒光染料特性，當內(nèi)膜電位小于 100 mV時， JC1以單體存在， 490nm激發(fā)光下形成綠色熒光；內(nèi)膜電位升高時， JC1在內(nèi)膜聚集形成橙色熒光。 （二）內(nèi)膜電位水平與線粒體正常功能密切相關(guān) 跨內(nèi)膜電位（質(zhì)子電化學梯度） 是反映線粒體呼吸鏈及合成 ATP功能的重要指標，被廣泛應(yīng)用。 （三）蛋白印漬技術(shù)測定 ATP合酶亞基表達 目 錄 二、測定蛋白復合物活性反映呼吸鏈電子傳遞功能 ? 基本方法： 反應(yīng)體系中含有待測復合體相應(yīng)底物、電子受體和下游復合體抑制劑，加定量線粒體蛋白溫育。加底物啟動反應(yīng)后，在線性范圍內(nèi)以特定波長，檢測底物 /產(chǎn)物的氧化 /還原水平改變。 （一）呼吸鏈蛋白復合體活性檢測顯示電子 傳遞速率 （二）蛋白印漬技術(shù)測定呼吸鏈復合體蛋白 表達