【正文】 或小麥 Yr Yr1 Yr36 等 基因 的材料。 12. 構(gòu)建 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和Yr10Yr18Yr36 聚合載體各 1 個 。 13. 獲得有 10 萬個體的 F2 群體，篩選獲得鑒定 Pigm 和 Pi9 基因的菌株 23個，特異鑒別這兩個基因的 PCR 分子標(biāo)記 23 個。 14. 發(fā)表 SCI 文章 10 篇左右。 15. 申請專利 56 個。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. PTI 通路新基因的克隆、鑒定 ； PRR 受體蛋白互作蛋白篩選 。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的分離純化及生化分析；效應(yīng)蛋白對宿主信號通路的作用分析 ； 抗病蛋白不同結(jié)構(gòu)域間互作分析，及這種互作與蛋白功能和下游信號通路之間的關(guān)系分型；構(gòu)建大麥表皮細(xì)胞富集百分病菌轉(zhuǎn)錄本的酵母雙雜交 cDNA 文庫的構(gòu)建。 3. 利用圖位克隆和高通量測序技術(shù)鑒定bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子所在的突變位點 ； 對 SAR 突變體進(jìn)行表型分型及初定位 ； 進(jìn)行 MEKK1免疫共沉淀 。 4. 鑒定 BBI1 （ E3 ligase ），OsRAR1,OsNPR1,OsSGT1 的感病純合突變單株 ,分別與含有 Pigm 轉(zhuǎn)基因日本晴株系雜交 。 5. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；分析其免疫應(yīng)答與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點 /關(guān)鍵分子 ； 通過轉(zhuǎn)錄組學(xué)方法篩選活性 EPS 寡聚體誘導(dǎo)表達(dá)的宿主植物基因。 6. 進(jìn)行抗病 TGS 目標(biāo)蛋白作用關(guān)鍵靶基因篩選、及其 DNA 的作用模式分析、同時進(jìn)行病毒侵染關(guān)鍵靶基因表達(dá)譜改變分析； 探索病毒侵染對水稻包括miRNA在內(nèi)的內(nèi)源 RNAs表達(dá)的影響。 7. 利用生物信息學(xué)方法對 Xoo 侵染水稻獲得的小 RNA 進(jìn)行分類 ， 預(yù)測小 RNA的靶基因 ； mRNA 表達(dá)譜分析。 8. 鑒定及獲得帶有乙烯耐受基因的抗性水稻株系；分析在阻斷乙烯反應(yīng)后對稻瘟病菌的抗病變化 。 鑒定及獲得組成性乙烯反應(yīng)的水稻材料株系；分析在組成性乙烯發(fā)育水稻株系中，具有抗性或是具有感病性水稻對病 原 菌侵染 的 反 應(yīng) 及 病 斑 程 度 。 利用microarray 等技術(shù)，分析 OsNPR1 基因介導(dǎo)的 SAR 與生長素信號途徑等之間1. 再分離鑒定 PTI途徑基因 12個 及 ETI途徑基因 12 個，并明確這些基因的功能。 再克隆病原菌效應(yīng)蛋白基因 12個，并認(rèn)識病原效應(yīng)蛋白基因的功能，分離其植物體內(nèi)的靶標(biāo)基因 35 個；鑒定抗病蛋白復(fù)合體組份 23 個，明確植物 NBLRR類抗病蛋白分子間的相互作用及對其功能的影響；找到bir1, snc1, snc2, snc4， mkk1 mkk2 的抑制子基因 34 個。 2. 明確水稻 OsFLS2 對鞭毛蛋白的感知能力；獲得涉及 2 個基因的變量表達(dá)的突變體株系； 構(gòu)建獲得 2 個水稻病原菌誘導(dǎo)表達(dá)的 cDNA 文庫。 3. 初步定位 12 個 SAR 突變體 ； 解析MEKK1 結(jié)合蛋白 ； 初步建立鑒定 Pigm的抗病防衛(wèi)反應(yīng)基礎(chǔ)信號網(wǎng)絡(luò)體系。 4. 得到宿主作物細(xì)胞在禾谷鐮孢侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組；揭示其與作物細(xì)胞本身能量、物質(zhì)代謝途徑交叉互作的結(jié)點 /關(guān)鍵分子。 5. 明確病毒 參與抗性 TGS 目標(biāo)蛋白 靶基因 DNA 甲基化的作用三者互作關(guān)系和調(diào)控模式 ； 得到一整套針對水稻RNA干擾途徑主要基因的穩(wěn)定的 RNAi突變體株系。 6. 對 LPS 受體基因進(jìn)行遺傳和物理定位；構(gòu)建候選 LPS 結(jié)合蛋白的水稻遺傳學(xué)研究株系。 7. 分析乙烯 反應(yīng)被阻斷后對水稻抗病性的影響及相關(guān)表型變化。 8. 鑒定與 RDV P2 蛋白互作的水稻蛋白并分析其可能的生化功能。 9. 篩選并獲得水稻 OsNPR1 基因調(diào)控的信號途徑下游成分并對其進(jìn)行遺傳分析。 10. 完成 ROD 基因功能鑒定工作； 完成水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定；獲得 Pigm/ROD 的 supprosser 的穩(wěn)定突變；定位克隆一個抗銹病 QTL； 11. 分別獲得 410 個 xa5Xa21Pid2Pid3 或 Yr10Yr18Yr36 陽性的轉(zhuǎn)基因株系 410 個 。 12. 創(chuàng)建 PID Yr Yr18 或 Yr36 基因 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 具有 crosstalk 功能的候選基因。 9. ROD 基因功能的鑒定工作；水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定工作；新廣譜抗病基因（ QTL）的定位工作；抗銹病 QTL 的定位工作 ； 研究抗黃萎病相關(guān)基因。 對上年度獲得的新型抗病等位基因（ PID Yr Yr18 和 Yr36 等 ），構(gòu)建 自然表達(dá) 載體并轉(zhuǎn)化到 水稻或小麥 中； 小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗證。 10. 分別將 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體和 Yr10Yr18Yr36 聚合載體導(dǎo)入水稻品種明恢系列或小麥品種濟(jì)麥等系列。 11. 通過突變、剪切或重組，創(chuàng)建 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因 的新型設(shè)計抗病基因 ； 水稻 Pigm 與 Pi9 基因重組位點的創(chuàng)建 ； 繼續(xù)水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育 ； 利用基因標(biāo) 記，繼續(xù)小麥 Yr Yr18 和Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。 的新 型設(shè)計抗病基因 25 個。 13. 篩選 5 萬個 F2 個體，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 23 株。 14. 發(fā)表 SCI 文章 1012 篇。 15. 申請專利 78 個。 第 三 年 1. PTI 通路新基因的生化和分子生物學(xué)分析 ； PRR 受體蛋白互作蛋白的功能鑒定。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白的糖基化分析及表型分析 ； 效應(yīng)蛋白靶蛋白的分離鑒定 ； 抗病蛋白互作蛋白的篩選 ；抗病基因和無毒基因互作的分子機制研究。 3. 對 bir1, snc1, snc2, snc4, mkk1 mkk2這5 個突變體做進(jìn)一步的抑制子篩選，克隆更多的基因 ； 利用圖位 克隆和全基因組測序技術(shù)篩選到 SAR 突變體的突變位點 ； MEKK1 結(jié)合蛋白及 FLS2介導(dǎo)的磷酸化蛋白的功能驗證 。 水稻MAPK 突變體， RNAi 植株純合及抗病分析。 4. 利用圖位克隆的方法鑒定 spi 基因。分析 LPS 結(jié)合蛋白和 LPS 受體在病原識別和植株發(fā)育過程中的功能。 5. 綜合運用 各種生物手 段具體研究禾谷1. 認(rèn)識 PTI 途徑相關(guān)基因編碼蛋白的生化和分子生物學(xué)特性 ； 明確 ETI 途徑相關(guān)基因編碼的抗病蛋白的生理生化特性 ； 明確病原菌效應(yīng)蛋白靶標(biāo)基因的功能及分子特性。 2. 克隆 12 個新的 bir1, snc1, snc2, 等的抑制子基因。 3. 明確 12 個 RLKs、 WRKYs 或 ERFs 在水稻抗病性中的作用；篩選獲得一批與 RLK、 WRKY或 ERF互作的候選蛋白；初步確定 PTI 中受調(diào)控的基因。 4. 確定 12 個 SAR 突變體的突變位點 ；解析連接 MEKK1 與 PRR 受體 FLS2 的蛋白組份。 5. 克隆到 1 個 Pigm 的抑制子 spi。 6. 明確 35個在宿主作物 禾谷鐮孢互作中起作用的重要基因 ； 初步揭示活性EPS 寡聚體對宿主植物抵抗病源菌入侵的作用 ； 明確靶基因?qū)Σ《厩秩镜膽?yīng)答效應(yīng)，及其參與的抗性途徑機制 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 鐮孢應(yīng)答基因在植病互作中起重要作用 ； 用不同的 EPS 寡聚體處理宿主植物，接種病源菌，觀察其侵染能力的變化。 6. 構(gòu)建關(guān)鍵靶基因過表達(dá)和敲除突變體，并進(jìn)行病毒侵染性的分析 ； 研究水稻 RNA 干擾途徑對病毒侵染的抵抗作用 ； 實驗驗證小 RNA 與潛在靶標(biāo)的調(diào)控關(guān)系；在水稻 dcl4 突變體中受Xoo 誘導(dǎo)的水稻小 RNA 的表達(dá)是否依賴 dcl4 基因。 7. 利用 RNAi 和過表達(dá)方法對 SA 與生長素途徑之間具有重要作用的基因進(jìn)行分析，闡明其遺傳學(xué)功能。 8. 繼續(xù) ROD 基因研究工作 ； 水稻抗白葉枯病基因（ QTL）的功能鑒定 ， 克隆 2個新的廣譜抗病基因（ QTL ） ；Pigm/ROD 的 supprosser 突變基因的定位工作 ； 新的抗銹病 QTL 的定位；繼續(xù)克隆抗黃萎病相關(guān)基因。 利用攜帶新型等位基因（ PID Yr Yr18 和Yr36 等 ）的轉(zhuǎn)基因植株，確定轉(zhuǎn)基因在受體基因組的 整合和表達(dá)模式 ； 小麥 EDR1 和 EDR2 同源基因 的功能驗證。 9. 評價 xa5Xa21Pid2Pid3 聚合載體對水稻白葉枯病和稻瘟病的 抗性特征；評價 Yr10Yr18Yr36 聚合載體對小麥條銹病的 抗性特征。 利用突變、剪切或重組等手段獲得的新型 PIDYr Yr18 或 Yr36 基因，構(gòu)建各自的自然表達(dá) 載體并轉(zhuǎn)化到 水稻品種明恢系列或小麥品種濟(jì)麥等系列 ； 水稻Pigm9 新位點的 功能評價。 10. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)水稻 xa Xa2Pid2 和 Pid3 基因的回交轉(zhuǎn)育 。 11. 利用基因標(biāo)記，繼續(xù)小麥 Yr Yr18 和 Yr36 基因的回交轉(zhuǎn)育。 和調(diào)控作用。 7. 找出參與抗病毒的 水稻 關(guān)鍵的 RNA干擾途徑的主要組份 ； 明確候選小RNA 的靶標(biāo)基因，及 Xoo 誘導(dǎo)的水稻小 RNA 是否依賴 RNA 沉默途徑。 8. 分析候選水稻 LPS 受體及結(jié)合蛋白的功能及在病原識別和發(fā)育調(diào)控中的分子功能。 9. 對乙烯途徑與水稻抗稻瘟病反應(yīng)中的關(guān)鍵基因進(jìn)行功能分析。 10. 研究 P2蛋白影響 GA合成途徑的關(guān)鍵因子 及影響機制 。 11. 分析 OsNPR1介導(dǎo)的 SA與生長素途徑之間的 crosstalk 及關(guān)鍵因子功能 ； 發(fā)表關(guān)于 ROD 基因研究工作的論文 ； 發(fā)表水稻抗白葉枯病基因（ QTL）功能相關(guān)的論文 ； 克隆 2 個新的廣譜抗病基因（ QTL） ； 克隆至少一個 Pigm/ROD的 supprosser 突變基因 ； 克隆一個新的抗銹病 QTL。 12. 確定 EDR1 和 EDR2 轉(zhuǎn)基因在受體基因組的整合和表達(dá)模式；獲得具有新型抗性特征的基因 12 個 ； 確定多基因聚合載體在受體基因組的整合和表達(dá)模式； 確定多基因聚合載體賦予受體植株的抗病特征。 13. 篩選 5 萬個 F2 個體 ，獲得 Pigm 和Pi9 重組的 F2 單株 23 株；獲得Pigm9 位點純合的單株 23 個。 14. 發(fā)表 SCI 收錄論文 1824 篇 。 15. 申請專利 1012 項。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 1. PTI 通路新基因在植物抗病途徑信號傳導(dǎo)途徑中作用及位置分析； PRR 受體蛋白互作蛋白下游信號通路研究。 2. Xoo 鞭毛蛋白 /解毒蛋白作用及機制分析 ； 效應(yīng)蛋白靶蛋白的功能分析 ；抗病蛋白互作蛋白的功能鑒定及分子生物學(xué)研究 ； 抗病基因和無毒基因互作的分子機制研究。 3. 熒光互補與免疫共沉淀研究 PTI 基因網(wǎng)絡(luò)中至少 2 個蛋白間的相互作用；構(gòu)建從酵母雙雜交或免疫 沉淀篩選到PTI 基因網(wǎng)絡(luò)中的重要組分的過量表達(dá)與 RNAi 轉(zhuǎn)基因植株，人工接種鑒定其抗病性 。 4. 利用酵母雙雜及免疫共沉淀技術(shù)，尋找其他參與 R 蛋白下游傳導(dǎo)的蛋白 及其他參與 SAR 下游傳導(dǎo)的蛋白 ； 深入解析 MEKK1 結(jié)合蛋白、 FLS2 介導(dǎo)的磷酸化蛋白的功能。水稻 MAPK 上下游蛋白元件分析。 5. 從蛋白生化反面分析 Pigm與 OsSGT1，BBI1， OsRAR1， OsNPR1 是否存在互作，結(jié)合遺傳的數(shù)據(jù)，建立 Pigm 的基礎(chǔ)抗病防衛(wèi)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)。 6. 采用激光顯微切割，基因組芯片等，揭示宿主作物細(xì)胞在活體 /半活體病原侵染早期的動態(tài)轉(zhuǎn)錄組 ； 通過分離、純化獲得活性寡聚體；應(yīng)用分離到的活性 EPS 寡聚體處理擬南芥，接種丁香假單胞菌。 7. 進(jìn)行病毒侵染前后靶基因相關(guān) siRNA northern blot、測序檢測；靶基因 DNA甲基化測序、 Southern blot 檢測和信息學(xué)分析；和上述在目標(biāo)突變體的研究結(jié)果相比較，研究突變體和病毒侵染對靶基因甲基化改變的相關(guān)性 ； 根據(jù)第 13 年的研究結(jié)果進(jìn)一步研究RNA 干擾的作用機理及其在抗病毒中的作用 ； 利用過表達(dá)人工 miRNA 等轉(zhuǎn)基因方法對 23 個水稻小 RNA 介導(dǎo)的抗病反應(yīng)進(jìn)行驗證 。 8. 闡明 LPS 結(jié)合蛋白和 LPS 受體的 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途