【正文】 緩沖劑溶解于水中配制而成的。生物體內(nèi)進行的各種生物化學(xué)反應(yīng)都是在一定的pH下進行的，為了能夠在實驗條件下準確模擬生物體內(nèi)的過程，必須保持體外的pH與體內(nèi)的基本一致。（三）電泳電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如多肽、核酸等都具有可解離的基團，在一定的pH下，這些基團會帶上正電或負電。在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極移動。電泳利用了待分離樣品中各分子帶電性質(zhì)的差異以及分子本身的大小、形狀的不同，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實現(xiàn)樣品中各種分子的分離。兩種常用的電泳方法是瓊脂糖凝膠電泳和聚丙烯酰胺凝膠電泳，在凝膠中加入SDS，電泳速率完全取決于分子大小，因此，在測定蛋白質(zhì)分子量時通常使用SDS—聚丙烯酰胺凝膠電泳。二、實驗操作蛋白質(zhì)的提取和分離一般分為四步：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。（一）樣品處理紅細胞的洗滌：洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白，采集的血樣要及時 分離紅細胞，分離時采用低速短時間離心（500r/min），然后用膠頭吸管吸出上層透明的黃色血漿，將下層暗紅色的紅細胞倒入燒杯，再加入五倍體積的生理鹽水（%），緩慢攪拌10min，低速短時間離心，如此重復(fù)洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。血紅蛋白的釋放：在蒸餾水和甲苯作用下，紅細胞破裂釋放出血紅蛋白。分離血紅蛋白溶液：將攪拌好的混合溶液離心（2000r/min）后，試管中的溶液分為4層。第一層為無色透明的甲苯層，第2層為白色薄層固體，是脂溶性物質(zhì)的沉淀層，第3層是紅色透明液體，這是血紅蛋白的水溶液，第4層是其他雜質(zhì)的暗紅色沉淀物。將試管中的液體用濾紙過濾，除去脂溶性沉淀層，于分液漏斗中靜置片刻后，分出下層的紅色透明液體。（二）粗分離：透析取1mL的血紅蛋白溶液裝入透析袋中，將透析袋放入盛有300mL的物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液（）中，透析12h。透析可以去除樣品中分子量較小的雜質(zhì)，或用于更換樣品的緩沖液。（三）純化：凝膠色譜操作制作凝膠色譜柱裝填凝膠色譜柱①裝填前將色譜柱垂直固定在支架上。因為干的凝膠和用緩沖液平衡好的凝膠的體積相差很大，所以裝柱前需要根據(jù)色譜柱的內(nèi)體積計算所需要的凝膠量。②裝填時凝膠要一次性緩慢倒入色譜柱內(nèi)，裝填時要輕輕敲動色譜柱，使凝膠裝填均勻，色譜柱內(nèi)不得有氣泡存在，一旦發(fā)現(xiàn)，必須重裝。③裝填完后，立即連接緩沖液洗脫瓶，在約50cm高的操作壓下，用300mL物質(zhì)的量濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液（）充分洗滌平衡凝膠12h，使凝膠裝填緊密。樣品的加入和洗脫①準備：打開色譜柱下端的流出口，使柱內(nèi)凝膠面上的的緩沖液與凝膠面平齊，關(guān)閉出口。②加樣：用吸管小心地將1mL透析后的樣品加到色譜柱的頂端，注意不要破壞凝膠面。加樣后打開下端出口，直到樣品完全進入凝膠層后，關(guān)閉下端出口。③洗脫：小心加入物質(zhì)的量的濃度為20mmol/L的磷酸緩沖液（）到適當高度，連接緩沖液洗脫瓶，打開下端出口進行洗脫。待紅色的蛋白質(zhì)接近色譜柱底端時，用試管收集。（四）純度鑒定：SDS聚丙稀酰胺凝膠電泳三、操作提示 紅細胞的洗滌 洗滌次數(shù)、離心速度與離心時間十分重要。洗滌次數(shù)過少，無法除去血漿蛋白；離心速度過高和時間過長會使白細胞等一同沉淀，達不到分離的效果。色譜柱填料的處理 商品凝膠使干燥的顆粒，使用前需直接放在洗脫液中膨脹。為了加速膨脹，可以將加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，逐漸升溫至接近沸騰，通常只需1—2h。這種方法不但節(jié)約時間，而且可以除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內(nèi)的空氣。凝膠色譜柱的裝填 在色譜柱中裝填凝膠的時候要盡量緊密，以降低凝膠顆粒之間的空隙。在裝填凝膠柱時，不得有氣泡存在。氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質(zhì)的洗脫次序，降低分離效果。在凝膠色譜操作過程中，不能發(fā)生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現(xiàn)象。一旦發(fā)生這種情況，凝膠色譜柱需要重新裝填。蛋白質(zhì)的分離 在蛋白質(zhì)分離過程中，仔細觀察紅色區(qū)帶在洗脫過程中的移動情況。如果紅色區(qū)帶均勻一致地移動，說明色譜柱制作成功。【教材答案】（一）旁欄思考題你能從凝膠色譜的分離原理分析為什么凝膠的裝填要緊密、均勻嗎？答：凝膠實際上是一些微小的多孔球體，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，從而使各種相對分子質(zhì)量不同的分子得以分離。如果凝膠裝填得不夠緊密、均勻，就會在色譜柱內(nèi)形成無效的空隙，使本該進入凝膠內(nèi)部的樣品分子從這些空隙中通過，攪亂洗脫液的流動次序，影響分離的效果。（二）練習(xí)1．答：凝膠色譜法也稱為分配色譜法，它是根據(jù)分子量的大小分離蛋白質(zhì)的方法之一。所用的凝膠實際上是一些微小的多孔球體，這些小球體大多數(shù)是由多糖類化合物構(gòu)成，小球體內(nèi)部有許多貫穿的通道，當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢流經(jīng)時，各分子在色譜柱內(nèi)進行兩種不同的運動，即垂直向下的運動和無規(guī)則的擴散運動。相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)分子不能進入凝膠顆粒內(nèi)部，只能分布在顆粒之間，通過的路程較短，移動速度較快；相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)分子比較容易進入凝膠內(nèi)的通道，通過的路程較長，移動速度較慢。因此，樣品中相對分子質(zhì)量較大的蛋白質(zhì)先流出，相對分子質(zhì)量中等的分子后流出，相對分子質(zhì)量最小的分子最后流出，這種現(xiàn)象又叫分子篩現(xiàn)象。2．答：在一定范圍內(nèi)，能對抗外來少量強酸、強堿或稍加稀釋不引起溶液pH發(fā)生明顯變化的作用叫做緩沖作用，具有緩沖作用的溶液叫做緩沖溶液。緩沖溶液通常是由1～2緩沖劑溶解于水中制得，調(diào)節(jié)緩沖劑的配比就可制得不同pH范圍的緩沖液。緩沖溶液的作用是維持反應(yīng)體系的pH不變。在生物體內(nèi)進行的各種生物化學(xué)過程都是在精確的pH下進行的，受到氫離子濃度的嚴格調(diào)控。為了在實驗室條件下準確地模擬生物體內(nèi)的天然環(huán)境，就必須保持體外生物化學(xué)反應(yīng)過程有與體內(nèi)過程完全相同的pH。3．答：電泳是指帶電粒子在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質(zhì)、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術(shù)就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質(zhì)以及分子本身大小、形狀等性質(zhì)的差異，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的。4．答：血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步,包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。l 首先通過洗滌紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品的處理；l 再經(jīng)過透析去除分子量較小的雜質(zhì)，即樣品的粗分離；l 然后通過凝膠色譜法將相對分子質(zhì)量大的雜質(zhì)蛋白除去，即樣品的純化；l 最后經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。5．答：血紅蛋白是有色蛋白，因此在凝膠色譜分離時可以通過觀察顏色來判斷什么時候應(yīng)該收集洗脫液。這使血紅蛋白的分離過程非常直觀，大大簡化了實驗操作。16