【正文】 點，與；另一分子氨基酸的羧基作用（用 DCC做偶聯(lián)劑）形成肽鍵； ? 重復(fù)（縮合 →洗滌 →去保護(hù) →中和和洗滌 →下一輪縮合）操作，達(dá)到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經(jīng)過純化等處理，即得到目標(biāo)的多肽 。 固相合成法的基本原理 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 樹脂的選擇 ?將固相合成與其他技術(shù)分開來的最主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求： ?必須包含反應(yīng)位點（或反應(yīng)基團(tuán)）； ?必須對合成過程中的物理和化學(xué)條件穩(wěn)定； ?允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速、不受阻礙的接觸； ? 提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給出有用產(chǎn)量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 主要有三類： 聚苯乙烯 苯二乙烯交聯(lián)樹脂 聚丙烯酰胺 聚乙烯 乙二醇類樹脂及衍生物 固相法合成多肽的高分子載體 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2C H C H 2聚苯乙烯樹脂 C H C H 2 C H C H 2 C H C H 2C O O H N H 2 C H 2 C l化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 ?這些樹脂只有導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)，才能直接連上第一個氨基酸； ?根據(jù)所導(dǎo)入反應(yīng)基團(tuán)的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為 氯甲基 樹脂、 羧基 樹脂、 氨基 樹脂； ?氨基酸的固定主要是通過保護(hù)氨基酸的羧基同樹脂的反應(yīng)基團(tuán)之間形成的共價鍵來實現(xiàn)的。 固相法合成多肽的高分子載體作用 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 ?氯甲基樹脂： 通常先制得保護(hù)氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當(dāng)溫度下，直接同樹脂反應(yīng)或在合適的有機(jī)溶劑如 DMF或 DMSO中反應(yīng)； ?羧基樹脂， 通常加入適當(dāng)?shù)目s合劑如 DCC或羧基二咪唑，使被保護(hù)氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定； ?氨基樹脂或酰肼型樹脂， 加入適當(dāng)?shù)目s合劑如 DCC后，通過保護(hù)氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。 高分子載體共價鍵形成的方法 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 ? 在固相合成絕大多數(shù)常用二氯甲烷為溶劑； ? a氨基用 Boc（叔丁氧羰基）保護(hù)的稱為 Boc固相合成法， ? a氨基用 Fmoc（芴甲氧羰基）保護(hù)的稱為 Fmoc固相合成法。 固相合成法的類型 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 丁氧羰基（ Boc）固相合成法 ? 側(cè)鏈保護(hù)基采用芐醇類； ? 常用樹脂為氯甲基化聚苯乙烯樹脂或羥甲基化聚苯乙烯樹脂或?qū)σ阴；S脂樹脂； ? Boc保護(hù) α氨基的氨基酸衍生物共價交聯(lián)到樹脂上，用 TFA脫除 Boc，三乙胺中和游離的氨基末端 ? 再偶聯(lián)下一個氨基酸， …… 。 ? 缺點： 反復(fù)用酸脫除保護(hù)基，然后用氟化氫把肽段從樹脂上裂解下來，不可避免地會引起或多或少的副反應(yīng)；某些側(cè)鏈保護(hù)基的不穩(wěn)定，已經(jīng)延長的肽鏈從固相支持物上的逐步損失，還有天冬氨酸、谷氨酸殘基的側(cè)鏈變化 …… 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 樹脂C H2C lt B oc N H C HR1C O OC H2樹脂t B oc N H C HR1C O OC F3C O O H或 H C L / C H3C O O H樹脂C H2N H 2 C HR1C O Ot B oc N H C HR2C O OD C CN H C HR1C O O C H 2 樹脂t B oc N H C HR2C O丁氧羰基（ Boc）固相合成法 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 Fmoc固相合成法 ? C末端氨基酸與樹脂結(jié)合 ? NaFmoc的脫除、洗滌 ? 偶聯(lián)、洗滌 ? 重復(fù) (2)～ (3)步 ? 脫保護(hù)基 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 Boc法用 TFA+HF裂解和脫側(cè)鏈保護(hù)基， Fmoc法直接用TFA，有時根據(jù)條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護(hù)方法也被采用。合成肽鏈進(jìn)一步的精制、分離與純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細(xì)管電泳等。 裂解及合成肽鏈的純化 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 固相合成法對于肽合成的顯著的優(yōu)點 ? 簡化并加速了多步驟的合成； ?因反應(yīng)在一簡單反應(yīng)器皿中便可進(jìn)行，可避免因手工操作和物料重復(fù)轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的損失； ?固相載體共價相聯(lián)的肽鏈處于適宜的物理狀態(tài)，可通過快速的抽濾、洗滌未完成中間產(chǎn)物的純化，避免了液相肽合成中冗長的重結(jié)晶步驟，可避免中間體分離純化時大量的損失； ? 固相載體上肽鏈和輕度交聯(lián)的聚合鏈緊密相混，彼此產(chǎn)生一種相互的溶劑效應(yīng)，這對肽自聚集熱力學(xué)不利而對反應(yīng)適宜。 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 固相合成存在的主要問題 ? 固相合成的主要存在問題是固相載體上中間體雜肽無法分離，這樣造成最終產(chǎn)物的純度不如液相合成物 。 ? 必需通過可靠的分離手段純化。 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 可溶性的問題 ? 許多合成的肽粗品，尤其是那些經(jīng)過幾次沉淀和干燥的，在標(biāo)準(zhǔn)的 HPLC溶劑中十分難溶，原因為： ? 含有大量的疏水性殘基，它們會象油一樣緊密的擁成一簇，以減少與水的接觸并增大 分子之間的疏水性作用。 ? 非特異性的聚集。 ? 含有 Cys的肽中形成二硫鍵。 ? 二級結(jié)構(gòu)的形成，特別是較長的分子。 ? 活性側(cè)鏈（包括各種類型的氫鍵、鹽橋等）之間的特異性相互作用 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 肽的溶解 ? 對于含有芳香或者烴側(cè)鏈的氨基酸（ Val、 Leu、 Ile、 Met、 Phe、 Tyr、Ala），加入 DMF至 50%溶解；或者加入最少量的 DMF，然后用緩沖液稀釋即可。但應(yīng)當(dāng)注意有機(jī)溶劑對于后續(xù)試驗的影響。 ? 如果含有較多的堿性氨基酸，可以用醋酸的水溶液（ 110%）進(jìn)行溶解。 ? 如果含有酸性的氨基酸，可以用揮發(fā)性的堿性緩沖液（ pH可以達(dá)到 8）如乙酸乙脂嗎啉或重碳酸鹽等溶解。 ? 如果序列比較長，有可能溶解于鹽溶液。高濃度的離液鹽，如鹽酸胍或脲等可以通過破壞其二級結(jié)構(gòu)而幫助其溶解。 ? 對于中等大小的分子，丙醇可以加速溶解。 ? 少量的 TFA可以幫助溶解聚集物 ? 可以加入去垢劑如 SDS進(jìn)行處理，但是需要注意的是含有聚醚的去垢劑可能會產(chǎn)生過氧化物從而損害某些肽?？蓮墓居嗁彿沁^氧化去污劑。 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 多肽的保存 ? 大多數(shù)多肽可以保存在 20℃ ，特別是冷凍干燥并保存在干燥器中，能夠在 20℃ 的條件下保存兩年而沒有問題。在將它們暴露于空氣之前， 冷凍的多肽和容器應(yīng)當(dāng)至少在室溫中放置 30 min以上時間，然后取用。 ? 這將避免多肽樣品吸收潮氣。當(dāng)無法冷凍干燥時，最好的方法是以小的工作樣量存放。 ? 對于含 Cys, Met 或 Trp的多肽，很容易受到空氣中的氧氣和溶解試劑的氧的影響而氧化。因此，避免此類多肽和氧接觸是很重要的。對其溶解時脫氧緩沖溶劑是必不可少的，在封瓶前，慢慢流過多肽的氮氣或氬氣也會降低氧化作用。 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 多肽合成儀 1996年， Merrifield等報道了最初的多肽合成儀，由 5部分組成： ?氨基酸溶液和選擇閥 ?洗滌溶液、脫保護(hù)試劑、中和試劑 ?反應(yīng)容器和振動裝置 ?送液、加壓裝置 ?廢液裝置 知識延伸 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 Pioneer多肽合成系統(tǒng) ? 二柱系統(tǒng)：獨立控制，獨立的試劑輸送及氨基酸瓶室，兩種多肽同時進(jìn)行 ? 每支柱系統(tǒng)有 101個氨基酸位置 ? 合成范圍寬廣 ? 每個合成循環(huán)小于 20分鐘，更有自動循環(huán)延時功能， ? 試劑消耗少 ? 多種專利活化試劑，獨有專利 PEGPS 樹脂 ? 全自動反饋控制下的在線檢測 ? 可進(jìn)行自動烯丙基反應(yīng)，合成側(cè)鏈，磷酸化，糖基化肽鏈 知識延伸 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 PSSM8型全自動多道固相多肽合成 儀 Model PSSM8 Automated SolidPhase Synthesizer 應(yīng)用于合成抗體，抗原表達(dá)和構(gòu)造活性相關(guān)的研究中使用 知識延伸 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 PSSM8的特點 : 可以合成高純度的多肽 ? 采用無交叉污染的和獨立的 8通道流路構(gòu)成 ? 采用反應(yīng)效率高的化學(xué)耦合方式 ? 采用氮氣吹泡進(jìn)行攪拌，以及氮氣加壓除去反應(yīng)后試劑，實現(xiàn)高反應(yīng)效率和有效地除去反應(yīng)后剩余試劑 適宜的合成范圍 ? 每個通道可合成 550μmol，滿足多肽的使用量，實現(xiàn)經(jīng)濟(jì)適用的合成 優(yōu)良的操作性能 ? 采用專用的合成計算軟件，非常容易的制定合成計劃 ? 合成儀自動控制合成過程，內(nèi)置的數(shù)據(jù)處理功能，不需要聯(lián)機(jī)的計算機(jī)系統(tǒng) 高度的靈活性 ? 靈活掌握合成的過程，對增添活化試劑，化學(xué)耦合劑以及氨基酸衍生物等簡單方便和容易 損失少的切樹脂過程 ? 在合成的專用反應(yīng)器中，直接進(jìn)行切樹脂操作，可實現(xiàn)高效的損失少的切樹脂過程 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 為科研型自動多肽合成儀 技術(shù)特點 : 操作簡單 ,基本單項多肽合成 物美價廉 不同程序的設(shè)計 多范圍的合成（ ） 合成率高、試劑兼容 Protein Technologies Model PS3 知識延伸 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 SYMPHONY/Multiplex―交響樂” 世界第一臺一次可合成 12個不同的復(fù)合多肽合成儀 技術(shù)特點 : 多功能 ,不同功能的多肽同時合成 低成本（ 百分之八十低于 ABI ） 唯一可自動切割的多肽合成儀 真正獨立可同時操作，非間斷性 可同時合成 48種不同多肽 循環(huán)時間最短，只需 45分鐘 唯一同時控制每個隅聯(lián)步聚的多肽合成儀 靈敏而精確的自動監(jiān)控液體全部傳輸 封閉系統(tǒng)含試劑蒸發(fā) 可供顧客編程，連續(xù)產(chǎn)肽 合成范圍： 5mM350mM 知識延伸 化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院 論文寫作簡單的格式 ? 題目 ? 作者 ? 作者單位 ? 中文摘要 ? 中文關(guān)鍵詞 ? 英文摘要 ? 英文關(guān)鍵詞 ? 正文 ? 致謝 ? 參考文獻(xiàn)