【正文】 檢測(cè)技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn) 二 .初篩及鑒定 rRNA分子在生物體中普遍存在，生物細(xì)胞 rRNA分子的一級(jí)結(jié)構(gòu)中既具有保守的片段，又具有變化的堿基序列。在生物進(jìn)化的漫長(zhǎng)過程中 ,rRNA分子保持相對(duì)恒定的生物學(xué)功能和保守的堿基排列順序 ,同時(shí)也存在著與進(jìn)化過程相一致的突變率 ,在結(jié)構(gòu)上可分為保守區(qū)和可變區(qū) , 保守的片段反應(yīng)了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變片段則能表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則是不同分類級(jí)別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎(chǔ)。研究 rRNA基因序列可以發(fā)現(xiàn)各物種間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系。細(xì)菌 rRNA按沉降系數(shù)分為 3種，分別為 5S、 16S和 23SrRNA。其中位于原核細(xì)胞核糖體小亞基上的 16SrRNA長(zhǎng)約 1540bp,結(jié)構(gòu)和堿基排列復(fù)雜度適中 ,較易于進(jìn)行序列測(cè)定和分析比較。 16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼 16SrRNA相對(duì)應(yīng)的 DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由保守區(qū)及可變區(qū)兩部分組成。因此可用 PCR擴(kuò)增其相應(yīng)的 rDNA片斷，來快速、靈敏地檢測(cè)樣品中是否存在某些細(xì)菌或致病菌，或進(jìn)行細(xì)菌多樣性分析，尤其是那些人工無法培養(yǎng)的微生物。 rRNA分子結(jié)構(gòu) (八 ).分子生物學(xué)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介 二 .初篩及鑒定 。（亦可使用選擇性培養(yǎng)基，如 PEA plate或 MCA plate）； ，分別接種至新的 TSA plate上，直到平板上的菌落為單一菌種為止； ，進(jìn)行 DNA的提取，分光光度計(jì)法及瓊脂糖凝膠電泳測(cè)定 DNA的質(zhì)量完整性和得 率； 16SrRNA的通用引物為引物進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物； PCR條帶，回收并純化 PCR產(chǎn)物； ，以 16SrRNA的通用引物為引物； GeneBank中進(jìn)行 Blast分析以確定該細(xì)菌所屬的類別 。 此方法適于突發(fā)性未知菌或變異菌污染的緊急檢測(cè)鑒定，而常規(guī)手段無法鑒定該細(xì)菌的種類，只有從基因水平來鑒定該細(xì)菌的種類。從細(xì)菌的分離純化到富集到檢測(cè)鑒定出結(jié)果，周期為 2天左右，整個(gè)費(fèi)用 。 (八 ).分子生物學(xué)鑒定技術(shù)簡(jiǎn)介 三 .污染源的追溯 (一 ).概述 ? 致病菌污染源的追溯就是在食品中檢出有致病菌時(shí) ,對(duì)原輔料及各個(gè)生產(chǎn)加工環(huán)節(jié) 中存在的致病菌進(jìn)行分離 、 純化 、 分型 ,并最終查找出導(dǎo)致終產(chǎn)品污染的源頭和原因的 過程 . ? ,進(jìn)而分析出污染爆發(fā)的原因 。 ,杜絕污染的再次爆發(fā) 。 . 三 .污染源的追溯 (一 ).概述 終產(chǎn)品致病菌的分離與純化與分型 原輔料及生產(chǎn)環(huán)節(jié)存在的致病菌的分離純化與分型 終產(chǎn)品中致病菌各亞型與中間環(huán)節(jié)致病菌各亞型的比對(duì) 找出污染的源頭和原因 每一種致病菌都可分為各種不同的亞型 ,這就像人可以分為黃種人白種人和黑種人一 樣 ,只有更為精細(xì)的分型才能更為有效的進(jìn)行污染源的追溯 .所以污染源的追溯主要 就是進(jìn)行致病菌的亞型分析 . 三 .污染源的追溯 (二 ).目前常用的致病菌污染源追溯方法 以生物梅里埃為代表 .用致病菌的不同亞型免疫動(dòng)物以產(chǎn)生不同的抗體 ,再用 這些不同的抗體來鑒定致病菌不同的亞型 .優(yōu)點(diǎn)是速度快 ,但極易出現(xiàn)假陰性 ,尤其 是致病菌產(chǎn)生變異或其毒力基因表達(dá)和遺傳成分不穩(wěn)定時(shí) .目前已經(jīng)很少被用來作 為致病菌污染源追溯了 . Biolog公司為代表，用致病菌不同亞型細(xì)微的形態(tài)差別和生理生化特性的不 同進(jìn)行分型分析，優(yōu)點(diǎn)是速度快，但極易出現(xiàn)假陽性和假陰性，而且分型時(shí)常常會(huì) 遇到似是而非的情況。目前基本不被用來做為致病菌的污染源追溯。 三 .污染源的追溯 (二 ).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. PFGE電泳方法簡(jiǎn)介 脈沖場(chǎng)凝膠電泳 (pulsedfield gel electrophoresis, PFGE)是一種非常有效的分子分型技 術(shù) ,基本原理是通過電場(chǎng)的不斷改變，使包埋在瓊脂糖凝膠中的 DNA分子的泳動(dòng)方向做相應(yīng)改變， 小的 DNA分子比大的變化快，故小分子泳動(dòng)得快，從而在凝膠上按染色體大小而呈現(xiàn)出電泳帶 型。 DNA帶的密度在一定程度上反映了細(xì)菌內(nèi) DNA的含量以及 DNA分子的大小，最終達(dá)到分型的目 的。 PFGE常用于基因組 DNA的分析，是目前分子流行病學(xué)調(diào)查最經(jīng)典的方法，已成功用于眾多微 生物的遺傳性分析，被世界上許多實(shí)驗(yàn)室作為菌株基因分型的參考方法，是迄今最常用的亞分類 方法。 優(yōu)點(diǎn)： PFGE具有重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定、易于標(biāo)準(zhǔn)化的優(yōu)點(diǎn)，能在細(xì) 菌基因組很龐大的情況下，盡可能反映較多的變異信息。 缺點(diǎn)：但是也存在一定的缺點(diǎn)，比如耗時(shí)；電泳帶型易受人為等多種因素的影響；并不是對(duì) 所有情況都適合；不能同時(shí)優(yōu)化膠的每個(gè)部分的條帶分布；不能確切地認(rèn)為相同大小 的條帶就是相同的 DNA片段；不同條帶之間并不是無關(guān)的、相互獨(dú)立的，而是互相聯(lián) 系的；一個(gè)酶切位點(diǎn)的變化可能引起不止一個(gè)條帶的變化；結(jié)果不易分析，沒有國際 統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，不易于在實(shí)驗(yàn)室之間進(jìn)行比較，且儀器價(jià)格昂貴。 三 .污染源的追溯 (二 ).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. PFGE電泳方法簡(jiǎn)介 PFGE電泳系統(tǒng) 三 .污染源的追溯 (二 ).目前常用的致病菌污染源追溯方法 3. PFGE電泳方法簡(jiǎn)介 三 .污染源的追溯 (三 ).DuPont公司 RiboPrinter174。 System簡(jiǎn)介 目前全球唯一的可用于致病菌污染源追溯的全自動(dòng)細(xì)菌基因分型的系統(tǒng) .整套系統(tǒng)基于細(xì)菌核糖體基因分型設(shè)計(jì) ,使用 EcoRI限制性酶切 rRNA 操縱子產(chǎn)生的不同的基因片段 ,然后凝膠電泳 ,對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行分析 .整套系統(tǒng)高度自動(dòng)化 ,只需檢測(cè)人員培養(yǎng)分離純化致病菌 ,然后上樣 ,上樣后所有操作由系統(tǒng)完成 ,結(jié)果分析也由系統(tǒng)給出 ,從而避免了人為操作和認(rèn)為判讀帶來的誤差 . DuPont公司 RiboPrinter174。 System 三 .污染源的追溯 (三 ).DuPont公司 RiboPrinter174。 System簡(jiǎn)介 DuPont公司 RiboPrinter174。 System對(duì)發(fā)生在廣東某地的金葡菌食物中毒的追溯報(bào)告 三 .污染源的追溯 Production QA/QC 生產(chǎn)質(zhì)控 Research amp。 Development 研發(fā) Clinical Trial Support 臨床試驗(yàn)支持 Assess efficacy of sanitation programs 評(píng)估衛(wèi)生設(shè)施的有效性 Ensure culture integrity 確保培養(yǎng)的完整性 Definitive geicsbased Identifications 確定的基于基因的鑒定方法 Expedite accurate decisionmaking 迅速準(zhǔn)確的決策 Track Sources of Contamination 追蹤污染源 Product Development ...the essential tool (三 ).DuPont公司 RiboPrinter174。 System簡(jiǎn)介 謝謝！