【文章內(nèi)容簡介】 段雙股 DNA又可當(dāng)作下一個循環(huán)模板，這樣每次循環(huán)都使得擴增的 DNA片段加倍。 (5).經(jīng)過 2040輪的 PCR反應(yīng)，目的基因被放大了上百萬倍。 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR產(chǎn)物 瓊脂糖凝膠電泳 經(jīng)過 2035輪的擴增后，特異的目 的基因（代表該微生物）被放大 了近百萬倍，將 PCR所得的產(chǎn)物進 行凝膠電泳，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn) DNA分子量 Marker進行比對，得出 PCR擴增有 沒有得到目的基因，進而推斷出 待檢物中有沒有該基因（該微生物）。 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 引物 任何一個生物體，總是有不同于其他同類的地方（更何況是和不同的物種比了），這也就是我之所以是我的原因，造成這一切的差異皆源于基因的差異。所以我們只要能找出每個生物的特異基因的話，也就能夠在基因?qū)用嫔蠈崿F(xiàn)對該生物的確認(rèn)了。換句話說，只要能檢出這段特異基因就能等于我們檢驗到了這個生物。這就像只要能找出二七紀(jì)念塔就等于找到了鄭州一樣。 然而這一切都要依靠引物的尋找！ 完美的引物 特異性的基因 該生物的確認(rèn) 完美的引物對于任何一家定量 PCR公司來說都是至高無上的機密！ (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 (肝炎病毒 ) (親子鑒定 )上的應(yīng)用 ,基因融合等 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR技術(shù)檢驗的優(yōu)缺點 (1).準(zhǔn)確 每種致病菌的引物和特異基因都是該試劑公司經(jīng)過長期研究和并反復(fù)試驗準(zhǔn)確無誤的，尤其是拿到了國際或國家檢驗標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)證的公司。 (2).快速高效 PCR檢驗不需要選擇性增菌，只需簡單富集一下，即可進行 PCR檢驗。一次可檢測 96— 384個樣品（大型 PCR檢測的樣品還可以更多）。一般 24小時之內(nèi)出結(jié)果。 (3).容易造成樣品間的交叉污染 由于普通 PCR的檢驗是在一個開放的系統(tǒng)中進行的，所以容易形成樣品間的交叉污染?，F(xiàn)在國家已經(jīng)明令禁止在醫(yī)院檢驗系統(tǒng)采用普通 PCR檢驗。 實時熒光定量 PCR（ RealTime PCR）的出現(xiàn)有效地解決了上述的問題，并成為了現(xiàn)在醫(yī)院檢測傳染性疾?。ǜ窝祝圆?，細(xì)菌感染）的首先。在食品微生物安檢領(lǐng)域，美國 DuPont公司研發(fā)的 BAX系統(tǒng)已獲 AOAC的認(rèn)證，并被多個國家所采納， 2022年 7月 9日被我國作為官方標(biāo)準(zhǔn)用于食品的檢驗，北京奧運會期間作為被用于奧運會食品安檢。 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR 概論 實時熒光定量 PCR技術(shù)于 1996年由美國 Applied Biosystems公司推出，由于該技術(shù)不僅實現(xiàn)了 PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī) PCR相比，它具有特異性更強、有效解決 PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前已得到廣泛應(yīng)用。 實時熒光定量 PCR： 在 PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個 PCR進程， 最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進行定量分析的方法。 定量 PCR儀是在普通 PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置， PCR擴增和檢測同時進行，最終結(jié)果不需進行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。 常 規(guī) PCR技術(shù)：對 PCR擴增反應(yīng)的終點產(chǎn)物進行定量和定性分析， 無法對起始模板準(zhǔn)確定量，無 法對擴增反應(yīng)實時檢測。 實時定量 PCR技術(shù)： 利用 熒光信號的變化實時檢測 PCR擴增反應(yīng)中 每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化 ， 通過 Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線的分析對 起始模板 進行定量分析 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR常用的三個常用概念 擴增曲線、熒光閾值、 Ct值 (1).擴增曲線：反映 PCR循環(huán)次數(shù)和熒光強度的曲線，定量 PCR儀每次輪 PCR擴增都會自動記錄熒光強 度的變化 熒光基團熒光基團熒光檢測元件熒光檢測元件擴增曲線圖：橫坐標(biāo)： 擴增循環(huán)數(shù)（ C y c l e ）； 縱坐標(biāo)： 熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集擴增曲線圖：橫坐標(biāo)： 擴增循環(huán)數(shù)（ ）； 縱坐標(biāo)： 熒光強度每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集每個循環(huán)進行一次熒光信號的收集 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR常用的三個常用概念 擴增曲線、熒光閾值、 Ct值 (2).熒光閾值： 樣本的熒光背景值和陰性對照的熒光值， 手動 設(shè)置的原則要大于樣本的熒光背景值 和陰性對照的熒光最高值，同時要盡量選擇進入指數(shù)期的最初階段，并且保證回歸 系數(shù)大于 。 (3).CT值： PCR擴增過程中，擴增產(chǎn)物的熒光信號達(dá)到設(shè)定的閾值時所經(jīng)過的擴增循環(huán)次數(shù)。 C(t) value (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR所用的熒光報告基團 (1).非特異性熒光標(biāo)記： SYBR Green (2).特異性熒光標(biāo)記： TaqMan探針 Molecular Beacon分子信標(biāo) (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 SYBR Green的特性 (1).SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈 DNA的小溝部位 (2).SYBR Green 只有和雙鏈 DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 (3).變性時， DNA雙鏈分開，無熒光 (4).復(fù)性和延伸時，形成雙鏈 DNA,SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。 SYBR Green SYBR Green (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 SYBR Green的工作原理圖解 5’ 3’ 5’ 3’ SG No Emission SG SG SG Excitation SG SG SG SG SG SG SG 5’ 3’ 5’ 3’ Emission Excitation 伴隨著每輪 PCR的進行，特異的基因片段不斷積累， SYBR Green不斷的與新增加的基因片段結(jié)合而發(fā)出熒光，熒光信號不斷積累，熒光定量 PCR儀實時記錄了熒光信號的變化。 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 SYBR Green的優(yōu)缺點 優(yōu)點： (1).對 DNA模板沒有選擇性 適用于任何 DNA (2).使用方便 不必設(shè)計復(fù)雜探針 (3).非常靈敏 (4).便宜 缺點： (1).容易與非特異性雙鏈 DNA結(jié)合，產(chǎn)生假陽性 但可以通過 融解曲線 的分析 ，優(yōu)化反應(yīng)條件 (2).對引物特異性要求較高 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 6. TaqMan水解型雜交探針 與目標(biāo)序列互補 TaqMan探針的特性： (1).5′ 端標(biāo)