【正文】 Development 研發(fā) Clinical Trial Support 臨床試驗支持 Assess efficacy of sanitation programs 評估衛(wèi)生設(shè)施的有效性 Ensure culture integrity 確保培養(yǎng)的完整性 Definitive geicsbased Identifications 確定的基于基因的鑒定方法 Expedite accurate decisionmaking 迅速準(zhǔn)確的決策 Track Sources of Contamination 追蹤污染源 Product Development ...the essential tool (三 ).DuPont公司 RiboPrinter174。 System簡介 目前全球唯一的可用于致病菌污染源追溯的全自動細(xì)菌基因分型的系統(tǒng) .整套系統(tǒng)基于細(xì)菌核糖體基因分型設(shè)計 ,使用 EcoRI限制性酶切 rRNA 操縱子產(chǎn)生的不同的基因片段 ,然后凝膠電泳 ,對電泳結(jié)果進(jìn)行分析 .整套系統(tǒng)高度自動化 ,只需檢測人員培養(yǎng)分離純化致病菌 ,然后上樣 ,上樣后所有操作由系統(tǒng)完成 ,結(jié)果分析也由系統(tǒng)給出 ,從而避免了人為操作和認(rèn)為判讀帶來的誤差 . DuPont公司 RiboPrinter174。 PFGE常用于基因組 DNA的分析，是目前分子流行病學(xué)調(diào)查最經(jīng)典的方法，已成功用于眾多微 生物的遺傳性分析，被世界上許多實驗室作為菌株基因分型的參考方法，是迄今最常用的亞分類 方法。 . 三 .污染源的追溯 (一 ).概述 終產(chǎn)品致病菌的分離與純化與分型 原輔料及生產(chǎn)環(huán)節(jié)存在的致病菌的分離純化與分型 終產(chǎn)品中致病菌各亞型與中間環(huán)節(jié)致病菌各亞型的比對 找出污染的源頭和原因 每一種致病菌都可分為各種不同的亞型 ,這就像人可以分為黃種人白種人和黑種人一 樣 ,只有更為精細(xì)的分型才能更為有效的進(jìn)行污染源的追溯 .所以污染源的追溯主要 就是進(jìn)行致病菌的亞型分析 . 三 .污染源的追溯 (二 ).目前常用的致病菌污染源追溯方法 以生物梅里埃為代表 .用致病菌的不同亞型免疫動物以產(chǎn)生不同的抗體 ,再用 這些不同的抗體來鑒定致病菌不同的亞型 .優(yōu)點是速度快 ,但極易出現(xiàn)假陰性 ,尤其 是致病菌產(chǎn)生變異或其毒力基因表達(dá)和遺傳成分不穩(wěn)定時 .目前已經(jīng)很少被用來作 為致病菌污染源追溯了 . Biolog公司為代表，用致病菌不同亞型細(xì)微的形態(tài)差別和生理生化特性的不 同進(jìn)行分型分析，優(yōu)點是速度快，但極易出現(xiàn)假陽性和假陰性，而且分型時常常會 遇到似是而非的情況。 此方法適于突發(fā)性未知菌或變異菌污染的緊急檢測鑒定，而常規(guī)手段無法鑒定該細(xì)菌的種類，只有從基因水平來鑒定該細(xì)菌的種類。 16SrDNA是細(xì)菌染色體上編碼 16SrRNA相對應(yīng)的 DNA序列，存在于所有細(xì)菌染色體基因中，它的內(nèi)部結(jié)構(gòu)由保守區(qū)及可變區(qū)兩部分組成。在生物進(jìn)化的漫長過程中 ,rRNA分子保持相對恒定的生物學(xué)功能和保守的堿基排列順序 ,同時也存在著與進(jìn)化過程相一致的突變率 ,在結(jié)構(gòu)上可分為保守區(qū)和可變區(qū) , 保守的片段反應(yīng)了生物物種間的親緣關(guān)系，而高變片段則能表明物種間的差異，那些保守的或高變的特征性核苷酸序列則是不同分類級別生物（如科、屬、種）鑒定的分子基礎(chǔ)。 (3).在目前食品致病菌的所有檢測方法種，分子生物學(xué)檢測技術(shù)最為先 進(jìn)。有化學(xué)發(fā)光則為陽性，沒有化學(xué)發(fā)光則為陰性?；蛐酒臏y序原理是雜交測序方法，即通過與一組已知序列的核酸探針雜交進(jìn)行核酸序列測定的方法 。 (6).所用試劑和儀器價格昂貴。一次可檢測 96—384個樣品（大型 PCR檢測的樣品還可以更多），使用復(fù)合引物的話，一次可檢測好幾種致病菌，一般 24小時之內(nèi)出結(jié)果。 system is used worldwide. AOAC International AOAC Research Institute AFNOR NordVal Certifications USDAAPHIS NPIP Brazil MAPA People’s Republic of China AQSIQ Health Canada Danish Veterinary and Food Administration Russian Rospotrebnadzor Japanese Ministry of Health, Labour and Welfare Approvals USDAFSIS Adoption 二 .初篩及鑒定 DuPont Qualicon在中國 7月 9日被我國作為官方 標(biāo)準(zhǔn)用于食品的檢驗。 但是目前市售熒光定量 PCR試劑盒采用的都是 TaqMan探針法。 C(t) value (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR所用的熒光報告基團(tuán) (1).非特異性熒光標(biāo)記： SYBR Green (2).特異性熒光標(biāo)記： TaqMan探針 Molecular Beacon分子信標(biāo) (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) RealTime PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 SYBR Green的特性 (1).SYBR Green 能結(jié)合到雙鏈 DNA的小溝部位 (2).SYBR Green 只有和雙鏈 DNA結(jié)合后才發(fā)熒光 (3).變性時， DNA雙鏈分開，無熒光 (4).復(fù)性和延伸時，形成雙鏈 DNA,SYBR Green 發(fā)熒光，在此階段采集熒光信號。 定量 PCR儀是在普通 PCR儀的基礎(chǔ)上加裝了熒光激發(fā)裝置和熒光檢測裝置， PCR擴(kuò)增和檢測同時進(jìn)行，最終結(jié)果不需進(jìn)行電泳檢測，所以有效地避免了樣品間的交叉污染。 實時熒光定量 PCR（ RealTime PCR）的出現(xiàn)有效地解決了上述的問題，并成為了現(xiàn)在醫(yī)院檢測傳染性疾?。ǜ窝?，性病，細(xì)菌感染）的首先。一次可檢測 96— 384個樣品（大型 PCR檢測的樣品還可以更多）。換句話說，只要能檢出這段特異基因就能等于我們檢驗到了這個生物。 (5).經(jīng)過 2040輪的 PCR反應(yīng)，目的基因被放大了上百萬倍。該步驟時間依賴于聚合酶以及需要合成的 DNA片斷長度。該步驟時間 12分鐘。該步驟時間 12分 鐘。為防止反應(yīng)體系中液體蒸發(fā)，通常在反應(yīng)管上加蓋加熱的蓋子，或者在反應(yīng)體系表面加入一層石蠟油。 （ 4） .脫氧單核苷酸（ dNTP），用于構(gòu)造新的互補(bǔ)鏈。例如，人的體細(xì)胞 DNA含有大約 30億個堿基對。 (五 ).分子生物學(xué)檢測技術(shù) PCR技術(shù)詳解 二 .初篩及鑒定 PCR用于擴(kuò)增一小段已知的 DNA片斷，可能是單個基因，或者僅僅是某個基因的一部分。539。在用于 PCR反應(yīng)時，高溫并不能破壞這種 DNA聚合酶，因此不需要不斷加入新的聚合酶， PCR反應(yīng)由此變得簡單并且可以由機(jī)器操作。但是在這個溫度下， DNA聚合酶被破壞，因此在每個循環(huán)的加熱步驟后必須補(bǔ)充新的聚合酶。當(dāng) DNA開始復(fù)制時，解旋酶將雙股的 DNA分開成兩個單股。 (四 ).分子生物學(xué)理論基礎(chǔ) 二 .初篩及鑒定 、 DNA和核酸 核酸的性質(zhì)： ，復(fù)性和雜交 變性 復(fù)性 雜交 (四 ).分子生物學(xué)理論基礎(chǔ) 二 .初篩及鑒定 聚合酶鏈鎖反應(yīng)， Polymerase chain reaction，簡稱 PCR， PCR這項技術(shù)是由凱利 ④加熱、低鹽及強(qiáng)酸、強(qiáng)堿均可使 DNA變性。如下圖： (四 ).分子生物學(xué)理論基礎(chǔ) 二 .初篩及鑒定 、 DNA和核酸 核酸的性質(zhì)：