【正文】 1 表面結構中等不規(guī)則 2 表面結構嚴重不規(guī)則 3 過渡層出現(xiàn)裂隙 4 輻射層出現(xiàn)裂隙 5 鈣化層出現(xiàn)裂隙 6 過渡層消失 7 輻射層消失 8 鈣化層消失 9 結構完全破壞 10 Ⅱ .細胞 1. 切線的區(qū)域 正常 0 細胞腫脹 1 細胞消失 2 2. 過渡和輻射的區(qū)域 正常 0 少量的細胞增多 1 中等量的細胞增多 2 大量 的細胞增多 3 少量的克隆 4 中等量的克隆 5 大量的克隆 6 少量的細胞減少 7 中等量的細胞減少 8 大量的細胞減少 9 細胞消失 10 17 Ⅲ .變異標記 完整 0 多層 1 模糊 2 血管的交叉 3 Ⅳ .血管翳形成 沒有 0 少量 1 中等量 2 大量 3 對體外培養(yǎng)兔膝關節(jié)軟骨細胞的影響 兔膝軟骨細胞的原代培養(yǎng) 無菌條件下取兩周齡新西蘭白兔后肢關節(jié)，用刀片取關節(jié)表面軟骨，收集在含磷酸緩沖 液（ PBS）的無菌小培養(yǎng)皿內(nèi)，反復清洗除去軟骨片表面的血液，以及可能勿帶之滑膜組織。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細切至不大于 1mm3。切碎后將其裝入 10u 試管內(nèi)，按 1： 10 量加入消化酶類進行化學解離。先用 %胰酶消化 30min，然后去除胰酶，加入 %膠原酶Ⅱ消化 7~8 小時后， 1500rpm10min 離心，棄上清，加入 PBS，搖勻在同上離心棄上清，在加 PBS 反復三次，最后一次加含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻， 200 目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中， 5%CO237℃培養(yǎng)箱 培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用 %胰酶消化傳代。 對軟骨細胞增殖反應的作用 將在培養(yǎng)瓶中長滿的細胞消化，接入 96 孔培養(yǎng)板中， 100ul/孔， 待細胞長成單層后，將舊液棄去，用 PBS 輕輕蕩洗一遍，然后加入含藥血清， 100ul/孔，每組 4 個復孔。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育 72h 后，取上清液。每孔加入 MTT 試劑 20ul（ 5g/L）既無血清培養(yǎng)液 100ul，再孵育 4h。取上清，每孔加入 200ul 溶甲瓚液，以主波長 570nm，參比波長 690nm 于酶標儀上比色，讀取吸光度（ A）值。 對軟骨細胞的細胞凋亡的影響 單層細胞培養(yǎng)板制作同上，加入含藥血清，每組 4 個復孔，于 5%CO237℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 48h，棄去舊液，用 %胰酶消化待細胞有變圓趨勢即取出消化液，加入 PBS，用吸管輕輕吹打，使成單個細胞懸液，移入離心管離心， 1000rpm， 5min，去掉上清液，約留 細胞懸液，用振蕩器使細胞分散，用細滴管或注射器將細胞迅速注入 4℃冷乙醇中（乙醇終濃度為 70%），用細胞流式儀檢測凋亡細胞數(shù)目，計算凋亡百分率。 對軟骨細胞蛋白合成和 NO 含量的影響 同樣將各組 含藥血清加入已長 18 成單層細胞的培養(yǎng)板內(nèi)， CO2 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48h 后，收集上清液，用全自動生化分析儀檢測總蛋白含量，用分型 NOS 試劑盒和 NO 試劑盒檢測各組 iNOS、 NO 含量。 ? 拆方后對軟骨細胞的影響 進行拆方實驗，篩選出補肝腎組方、祛風濕組方和化瘀痰組方三組，對這三組及復方分別進行體外的軟骨細胞實驗，設立陽性對照組（維骨力組）： 細胞毒性實驗 將各組方藥液用培養(yǎng)基分別配成幾個待測濃度，加入已長成單層細胞的培養(yǎng)板內(nèi)，分別觀察 24h、 48h、 72h 細胞形態(tài)的變化，選擇細胞不發(fā)生變圓、萎縮、漂 浮的最大濃度為藥物對細胞的最大無毒濃度，以便繼續(xù)實驗。 對軟骨細胞的細胞凋亡、增殖、 NO 含量及 iNOS 基因表達的影響 將各組方藥液分別配置成最大無毒濃度，加入已長成單層軟骨細胞的細胞培養(yǎng)板內(nèi)，具體檢測操作則同加入含藥血清的實驗。 本課題主要承擔者是江蘇省中醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所。本所具有江蘇省科學技術委員會，江蘇省標準局頒布的動物飼育環(huán)境合格證書，動物質量合格證書，人員素質高，均擁有實驗動物從業(yè)人員崗位證書。儀器設備先進完善，擁有無菌室，能夠進行細胞培養(yǎng)及指標檢測等一系列工 作，具有較強的科研能力。本組方的提供者是本院的風濕科，該科擁有專科病房（ 20 張病床）及全天?？崎T診，同時還開展了專病門診（包括OA），技術力量較強，技術水平較高，在省內(nèi)外中西醫(yī)風濕界均有一定的影響。本課題負責人朱萱萱主任藥師，副教授，是省藥理學會理事、中華中醫(yī)藥學會制劑分會委員。主要從事中藥藥理，毒理和中藥制劑的研究工作。 《養(yǎng)陰生肌膜治療口腔潰瘍的臨床及實驗研究》獲省中醫(yī)藥科技進步一等獎、排名第 3；《保精片治療前列腺炎的實驗研究》獲省中醫(yī)藥科技進步二等獎、排名第 4 ；《中醫(yī)治療原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性臨床及機 理研究》獲省中醫(yī)藥科技進步一等獎、排名第 5；《小兒退熱滴腸液的臨床研究》獲省中醫(yī)藥科技進步二等獎、排名第 4；《洋金花傷膏》獲省中醫(yī)藥科技進步二等獎、排名第 4；《克乳痛治療乳腺炎的臨床及機理研究》獲省政府二等獎、排名第 6；《津血源治療干燥綜合癥的臨床及實驗》獲省政府三等獎、排名第 5；《宮頸寧治療宮頸炎的臨床及實驗研究》獲省中醫(yī)藥科技進步二等獎、排名第 5；《養(yǎng)心托毒顆粒劑治療病毒性心肌炎的臨床機理研究》獲省政府三等獎、排名第 5；《血康糖漿治療小兒貧血的臨床和實驗研究》獲市科技進步三等獎、排名第 3；《中藥緩釋口腔 粘附片的研制》獲市科技進步三等獎、排名第 1。通過成果鑒定項目有：《病毒清眼膜的研制》《消癥 19 飲治療子宮內(nèi)膜異位癥臨床和實驗研究》《強心合劑治療心衰的臨床及實驗研究》《病竇靈治療竇房結綜合癥臨床及實驗研究》《烏鱉口服液治療卵巢功能早衰的實驗研究》《 益腎健脾顆粒劑治療青春期功血的臨床和實驗研究》《四通顆粒劑與紫外線照射充氧自血回輸結合治療急性缺血性中風的臨床及機理研究》 《熱痹消治療急性痛風性關節(jié)炎的研究》 《從脾肺論治免疫性潰瘍性結腸炎（ IUC）的臨床和實驗研究》《大黃蟄蟲丸對阿霉素腎病伴高血脂癥大鼠的實驗 研究》 《滋陰抑元顆粒對免疫性不孕的機理研究》 《腦血通對急性出血性腦中風的實驗研究》 《茱萸顆粒對病毒性心肌炎免疫損傷作用的研究》。完成新藥基金的藥效學和毒理學研究 3 項，其中 1 項為 863 計劃，編號 2022AAZ3214，排名第 5； 1 項為口腔膜的研制（省中管局）排名第 1； 1 項為薤白膠囊的研制， (省科委高新開發(fā)項目 )，排名第 4。 近年來發(fā)表論文33 篇，其中國家級刊物 30 篇 [第一作者 30 篇 ]，省級刊物 3 篇 [第一作者 3 篇 ] 。 現(xiàn)階段我們已完成了一部分痛痹顆粒機理的實驗研究，其中包括該方抗炎鎮(zhèn)痛作用、抗氧化作用及 改善血液微循環(huán)等方面一系列的實驗工作， 同時我們也進行了一些預實驗，包括對 OA 模型的復制等。 已有以下主要儀器設備，可滿足本項研究使用。 超低溫冰箱 MDF382E 日本三洋公司 倒置顯微鏡 CK 日本 TOKYO 公司 紫外分光光度計 751G 上海分析儀器總廠 低溫高速離心機 德國 HERMLE 公司 蛋白核酸分析儀 DU600 美國 Beckman 公司 PCR 儀 PE9600 美國 PE 公司 96 孔酶標儀 3550 美國 BioRad 公司 紫外線檢測儀 ZF2 上海長興機械廠 DNA 熒光定量分析儀 LightCycle 美國 Roche 公司 FA1004 電子天平 上海天平廠 凈化工作臺 蘇州凈化設備廠 CO2 恒溫培養(yǎng)箱 德國賀利氏公司 欠缺的有 TBX2 細胞流式儀 計劃進度： 20 總研究期限？年（ 2022. 4 ~200 ）分三個階段實施。 第一階段：（ ~）調研及資料檢索，準備階段并上報待批。 第二階段：（ ~200 ）完成全部實驗工作。 第三階段：（ 200 ）資料匯總、總結、處理數(shù)據(jù)、分析與研究成果撰寫論文、上報鑒定、鑒定后申報成果。 經(jīng)費預算： 檢索、調研、研制藥物、檢查費、購買特殊試劑盒、打字復印約 2 萬。 動物實驗、藥理、毒理、細胞培養(yǎng)材料約 3 萬。 總計 5 萬 主要研究人員 姓名 性別 年齡 單位 專業(yè) 職務 在本項目中的主要工作 朱萱萱 女 江蘇省中醫(yī)院 藥學 主任藥師 課題負責人 董朝嵐 女 24 南京中醫(yī)藥大學 藥學 藥理毒理 劉麗敏 女 27 南京中醫(yī)藥大學 藥學 藥理毒理 聞國蘭 女 江蘇省中醫(yī)院 動物飼養(yǎng)