【正文】 ）誘發(fā)性 胃癌動(dòng)物模型 造模機(jī)制 甲基硝基亞硝基胍和甲基膽蒽為常用致癌物。 操作方法和結(jié)果 甲基硝基亞硝基胍（ MNNG）誘發(fā)大鼠胃癌：體重 100g作用的雄性 Wistar大鼠，自由飲用 30100μg/mL的 MNNG水溶液，不給予其他飲水，持續(xù) 6個(gè)月以上 ，其發(fā)生率在 80%左右，以高分化腺癌為主。 一、 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型 （四）誘發(fā)性 結(jié)腸癌動(dòng)物模型 造模機(jī)制 動(dòng)物結(jié)腸癌自然發(fā)生率很低，目前常用的致癌物以二甲基芐肼較好，即可口服又可注射。 操作方法和結(jié)果 二甲基芐肼（ DMH）誘發(fā)大鼠結(jié)腸癌：選 6周雄性 Wistar大鼠。將 MMNG用 33%的乙醇配成 %的醇溶液，用導(dǎo)尿管由肛門(mén)插入 78cm深（相當(dāng)于結(jié)腸左曲部），注入 MMNG ，每周 2次，共 25次。于實(shí)驗(yàn) 1213個(gè)月處死動(dòng)物，誘發(fā)的結(jié)腸癌主要發(fā)生在腸壁粘膜面，多為腺癌和混合癌。 一、 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型 ? 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型的注意問(wèn)題： 1. 必須適當(dāng)選擇： 致瘤方法 、 動(dòng)物種系 、 致癌物種類(lèi)與溶劑 、 給藥劑量與途徑 及 觀(guān)察時(shí)間 等盡量簡(jiǎn)便可行，有較好的重復(fù)性，并有利于與人腫瘤比較 。 2. 早期應(yīng)預(yù)防動(dòng)物感染，特別是肺部感染。 3. 注意環(huán)境污染。 一、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型 ? 誘發(fā)性 腫瘤動(dòng)物模型的評(píng)價(jià) : 1. 約 80%的人類(lèi)癌癥是由環(huán)境引起，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物誘發(fā)性腫瘤的病因與人類(lèi)癌癥的情況相近。 2. 誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型最大的缺點(diǎn)是誘癌時(shí)間長(zhǎng)，動(dòng)物之間的個(gè)體差異大。 一、誘發(fā)性腫瘤動(dòng)物模型 二、移植性動(dòng)物模型 第四章 腫瘤疾病動(dòng)物模型 移植性腫瘤動(dòng)物模型的概念 是指將動(dòng)物或人腫瘤移植到同種或異種動(dòng)物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成的腫瘤。 目前，臨床上常用的抗腫瘤藥大多是 首先經(jīng)動(dòng)物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的 。 動(dòng)物選擇 大、小鼠、地鼠 腫瘤細(xì)胞選擇 腫瘤細(xì)胞株是指通過(guò)選擇法或克隆法從 原代培養(yǎng)物 或 細(xì)胞系中獲得的具有 特殊遺傳、生化性質(zhì)的細(xì)胞群 。 原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即為 細(xì)胞系 。 瘤株在 組織形態(tài) 和 生長(zhǎng)特性 方面趨于 穩(wěn)定 ，并能在同系、同種或異種動(dòng)物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。 二、移植性動(dòng)物模型 腫瘤細(xì)胞選擇 目前，動(dòng)物移植性實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤（ 實(shí)體瘤、腹水瘤和白血病 ）種類(lèi)很多，常用有 40多種， 多為小鼠腫瘤 。 瘤株的選擇應(yīng)盡量考慮與臨床擬研究的腫瘤性質(zhì)、部位 相近 。 二、移植性動(dòng)物模型 移植方法 ： (1)一般要求 整個(gè)過(guò)程應(yīng)在 無(wú)菌條件下 進(jìn)行；對(duì)實(shí)體瘤應(yīng)用滅菌的手術(shù)器械切取，對(duì)腹水瘤應(yīng)用注射器抽吸； 常接種的部位：實(shí)體瘤可接種腋窩皮下，肌肉接種用大腿??；腹水瘤接種于腹腔。 二、移植性動(dòng)物模型 （ 2）接種操作 ? 接種的基本過(guò)程 凍存的瘤株 移入宿主體內(nèi) 獲得瘤塊 （瘤源動(dòng)物） 制備瘤塊 給動(dòng)物接種 710d 二、移植性動(dòng)物模型 A、實(shí)體瘤 ? 瘤塊接種法： 腫瘤細(xì)胞皮下接種 ——710d處死荷瘤動(dòng)物 ——選擇生長(zhǎng)良好、無(wú)壞死液化的瘤組織 ——23 mm3 + 生理鹽水或其它營(yíng)養(yǎng)液 ——無(wú)菌套管針抽吸 ——接種同種受體動(dòng)物 右前腋窩皮下 。 二、移植性動(dòng)物模型 ? 瘤細(xì)胞懸液接種法： 接種動(dòng)物較多 無(wú)菌取出瘤塊，將瘤塊剪成小塊，放入玻璃勻漿器中，加無(wú)菌生理鹽水研磨后， 經(jīng) 80100目網(wǎng)篩過(guò)濾 ，加生理鹽水稀釋成 1： 3～ 1： 4（腫瘤 g：生理鹽水 mL）的單細(xì)胞懸液，用胎盤(pán)藍(lán)染色法計(jì)數(shù)，用 1mL注射器注射到接種部位，每點(diǎn)接種 mL（含 1 106～ 107個(gè)細(xì)胞），每只動(dòng)物可有多個(gè)接種點(diǎn)。 二、移植性動(dòng)物模型 ? 培養(yǎng)細(xì)胞接種法： 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用 %胰蛋白酶消化脫壁后，用 PBS以 1000 r/min 離心 10 min，洗滌 2次；用胎盤(pán)藍(lán)染色計(jì)數(shù)，生理鹽水稀釋?zhuān)?1mL注射器注射到接種部位，每點(diǎn)接種 （含1 106～ 1 107個(gè)細(xì)胞），每只動(dòng)物可有多個(gè)接種點(diǎn)。 二、移植性動(dòng)物模型 B、腹水瘤 （ 1）抽取腹水 選擇接種后 57d的瘤源動(dòng)物，脫臼致死，腹部消毒，打開(kāi)腹腔，用注射器抽吸腹水，抽出的腹水。另取少量腹水，置于加有肝素的試管內(nèi)，用于細(xì)胞計(jì)數(shù)；用生理鹽水將腹水稀釋至適當(dāng)濃度，每只鼠腹腔注射 mL（含 1 106～ 1 107個(gè)細(xì)胞 )。 二、移植性動(dòng)物模型 （ 一 ）兔 VX2肝癌模型 造模機(jī)制 VX2瘤株 性質(zhì)穩(wěn)定，增殖迅速，短期內(nèi)即可發(fā)生廣泛壞死，并形成肝、肺轉(zhuǎn)移，故 VX2腫瘤瘤株在大型動(dòng)物模型的研究上具有很高的應(yīng)用價(jià)值。 二、移植性動(dòng)物模型 造模方法 （ 1）腫瘤組織塊直接接種法 將兔子全麻后無(wú)菌條件下逐層開(kāi)腹，暴露肝臟，以眼科鑷于肝左中央葉較厚處刺破肝組織并形成口小(3～ 5mm)底大 (5～ 8mm)的“ 燒瓶 ”樣竇道，將 2～ 3塊剪碎的瘤株植入其中，并以明膠海綿碎塊埋塞竇口。確認(rèn)止血后回納肝臟，逐層關(guān)腹。 （一）兔 VX2肝癌模型 術(shù)中還應(yīng)注意： (1)瘤株制備時(shí)要將壞死組織及纖維組織剔除干凈，以免影響成功率。 (2)注意無(wú)菌操作，避免感染所致接種失敗。 (3)塞入瘤株碎塊后，應(yīng)以明膠海綿填塞竇口，一來(lái)可避免瘤塊溢出造成腹腔種植；二則可使瘤株盡可能種植在肝左葉深部，可使瘤灶靠近較大血管支易于獲得血。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 2）超聲穿刺接種 采用 B超掃查待接種兔肝臟，明確兔肝位置并確定待接種部位，選定穿刺點(diǎn)、角度、深度。 用穿刺針芯穿刺針沿設(shè)定的穿刺角度、方向穿入預(yù)定肝位置。助手固定好穿刺針，術(shù)者拔出針芯，眼科鑷夾 1塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù) 12次。術(shù)后預(yù)防感染。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 2）超聲穿刺接種 模型評(píng)價(jià)：采用直接穿刺法復(fù)制出的 VX2兔肝癌模型具有方法簡(jiǎn)單、成功率高，模型性質(zhì)穩(wěn)定的特點(diǎn)。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 3）瘤細(xì)胞懸液經(jīng)肝包膜注入法 實(shí)驗(yàn)兔術(shù)前 12h內(nèi)禁食不禁飲。常規(guī)方法暴露肝臟。挑開(kāi)肝包膜，將 l mL VX2腫瘤細(xì)胞懸液用 16號(hào)針頭緩慢注人肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，壓迫止血。避免懸液外滲引起腹腔內(nèi)種植。拔針后立即用生理鹽水棉球輕壓針眼表面至徹底止血，逐層縫合腹壁傷口。術(shù)后應(yīng)預(yù)防感染。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 3） 瘤細(xì)胞懸液經(jīng)肝包膜注入法 模型評(píng)價(jià)：模型損傷小，易造成彌漫性肝臟腫瘤和 腹腔種植 。 （一）兔 VX2肝癌模型 應(yīng)用 建立局限于肝內(nèi)的獨(dú)立腫瘤模型，對(duì)臨床評(píng)價(jià)各種介入治療方案的療效及抗癌藥物的篩選等具有重要意義。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模機(jī)制 通過(guò)誘癌劑對(duì)正常大鼠誘發(fā)肝癌，且出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移如肝門(mén)淋巴結(jié)、肺轉(zhuǎn)移，應(yīng)用肝癌的原位肝移植法，可進(jìn)一步研究移植后復(fù)發(fā)的機(jī)制，為肝癌原位肝移植的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 （ 二）肝癌原位肝移植動(dòng)物模型 造模方法 給大鼠飲用含有 二乙基亞硝胺 （ DEN） 的消毒水70 d， DEN溶液每周配制 1次 ， 濃度為 %， 70 d后改為飲用普通消毒水 ， 誘癌后 140 d， 可作為 受體實(shí)施原位肝移植 。 術(shù)中要注意止血 。 術(shù)后自由飲食 ， 術(shù)后 3 d肌注氨芐西林 50 mg/d,以預(yù)防感染 。 （ 二）肝癌原位肝移植動(dòng)物模型 模型特點(diǎn) 飲水給藥比腹腔內(nèi)給藥更為簡(jiǎn)便 ， 誘癌時(shí)間短 ，誘癌效果確切 ， 成瘤病程較長(zhǎng) ， 有充足的時(shí)間觀(guān)察 。 應(yīng)用范圍 移植后腫瘤復(fù)發(fā)是肝移植治療原發(fā)性肝癌效果不佳的主要原因 ， 建立肝癌大鼠的原位肝移植模型 ， 多用于肝癌原位移植的復(fù)發(fā)機(jī)制的探討研究 。 （二）肝癌原位肝移植動(dòng)物模型 造模機(jī)制 裸鼠 先天性 T淋巴細(xì)胞缺陷，可用于人體腫瘤的體內(nèi)移植。 也可用免疫抑制劑或放射線(xiàn)降低動(dòng)物的免疫功能 (免疫抑制動(dòng)物 )，在進(jìn)行移植。 （三）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ） 造模方法 選取 35周齡，體重 1820 g的裸鼠。將患者手術(shù)新鮮標(biāo)本置于 RPMI1640培養(yǎng)液中，將新鮮無(wú)壞死的癌組織切成 1 mm3小塊。 用硫噴妥鈉 30 mg/kg 腹腔注射麻醉，常規(guī)方法暴露肝臟，將切小的組織塊用穿刺針植入肝實(shí)質(zhì)內(nèi)，無(wú)菌棉簽壓迫止血，無(wú)繼續(xù)出血時(shí)將肝臟返回腹腔，關(guān)閉腹腔。術(shù)后預(yù)防感染。 （五）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ） （三）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ）模型特點(diǎn) 移植瘤 保留了人體原發(fā)腫瘤的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)和功能 ，其細(xì)胞形狀、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類(lèi)型和分化程度均保持一致，具有 分泌甲胎蛋白和癌胚抗原的功能 。 （三）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ） 應(yīng)用 裸鼠人肝癌原位移植模型具有與近似人肝癌生物學(xué)和抗癌藥物動(dòng)力學(xué)特征，它應(yīng)用是研究肝癌耐藥機(jī)制的理想模型。 （三）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ） 注意事項(xiàng) 人肝癌原位移植于裸鼠的 不同部位其腫瘤學(xué)特性有明顯差異 。 （ 1）皮下接種法操作簡(jiǎn)單，易于觀(guān)察，但腫瘤生長(zhǎng)受局限，幾乎不轉(zhuǎn)移； （ 2）腹腔移植法由于位置深，難以觀(guān)察，潛伏期長(zhǎng)，可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶和癌性腹水。 （三）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ） 注意事項(xiàng) （ 3）原位移植瘤潛伏期短，生長(zhǎng)快，發(fā)生轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)和腹水比例高，在研究肝癌形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)移潛能方面優(yōu)于皮下途徑，尤其是腫瘤的生長(zhǎng)部位與人肝癌相似，其微觀(guān)環(huán)境對(duì)再現(xiàn)腫瘤細(xì)胞原有的特性有明顯的影響。 （三）人肝癌原位移植動(dòng)物模型（ 異種移植 ） ? 評(píng)價(jià) : 1. 同時(shí)接種同樣量的瘤細(xì)胞，生長(zhǎng)速度較一致，個(gè)體差異較小。 2. 接種成活率近 100%。 3. 對(duì)宿主影響相類(lèi)似。 4. 可連續(xù)傳代，試驗(yàn)周期短，條件易于控制。 5. 主要問(wèn)題是 宿主對(duì)移植物產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng) 。