【正文】 ）誘發(fā)性 胃癌動物模型 造模機制 甲基硝基亞硝基胍和甲基膽蒽為常用致癌物。 操作方法和結(jié)果 甲基硝基亞硝基胍（ MNNG）誘發(fā)大鼠胃癌：體重 100g作用的雄性 Wistar大鼠，自由飲用 30100μg/mL的 MNNG水溶液，不給予其他飲水，持續(xù) 6個月以上 ，其發(fā)生率在 80%左右，以高分化腺癌為主。 一、 誘發(fā)性腫瘤動物模型 （四）誘發(fā)性 結(jié)腸癌動物模型 造模機制 動物結(jié)腸癌自然發(fā)生率很低，目前常用的致癌物以二甲基芐肼較好，即可口服又可注射。 操作方法和結(jié)果 二甲基芐肼（ DMH）誘發(fā)大鼠結(jié)腸癌：選 6周雄性 Wistar大鼠。將 MMNG用 33%的乙醇配成 %的醇溶液，用導(dǎo)尿管由肛門插入 78cm深（相當(dāng)于結(jié)腸左曲部），注入 MMNG ，每周 2次，共 25次。于實驗 1213個月處死動物，誘發(fā)的結(jié)腸癌主要發(fā)生在腸壁粘膜面，多為腺癌和混合癌。 一、 誘發(fā)性腫瘤動物模型 ? 誘發(fā)性腫瘤動物模型的注意問題： 1. 必須適當(dāng)選擇： 致瘤方法 、 動物種系 、 致癌物種類與溶劑 、 給藥劑量與途徑 及 觀察時間 等盡量簡便可行，有較好的重復(fù)性，并有利于與人腫瘤比較 。 2. 早期應(yīng)預(yù)防動物感染，特別是肺部感染。 3. 注意環(huán)境污染。 一、誘發(fā)性腫瘤動物模型 ? 誘發(fā)性 腫瘤動物模型的評價 : 1. 約 80%的人類癌癥是由環(huán)境引起，實驗動物誘發(fā)性腫瘤的病因與人類癌癥的情況相近。 2. 誘發(fā)性腫瘤動物模型最大的缺點是誘癌時間長，動物之間的個體差異大。 一、誘發(fā)性腫瘤動物模型 二、移植性動物模型 第四章 腫瘤疾病動物模型 移植性腫瘤動物模型的概念 是指將動物或人腫瘤移植到同種或異種動物體內(nèi)連續(xù)傳代而形成的腫瘤。 目前，臨床上常用的抗腫瘤藥大多是 首先經(jīng)動物移植性腫瘤篩選而發(fā)現(xiàn)的 。 動物選擇 大、小鼠、地鼠 腫瘤細(xì)胞選擇 腫瘤細(xì)胞株是指通過選擇法或克隆法從 原代培養(yǎng)物 或 細(xì)胞系中獲得的具有 特殊遺傳、生化性質(zhì)的細(xì)胞群 。 原代培養(yǎng)細(xì)胞經(jīng)首次傳代成功后即為 細(xì)胞系 。 瘤株在 組織形態(tài) 和 生長特性 方面趨于 穩(wěn)定 ，并能在同系、同種或異種動物體內(nèi)移植并連續(xù)傳代。 二、移植性動物模型 腫瘤細(xì)胞選擇 目前，動物移植性實驗?zāi)[瘤（ 實體瘤、腹水瘤和白血病 ）種類很多，常用有 40多種， 多為小鼠腫瘤 。 瘤株的選擇應(yīng)盡量考慮與臨床擬研究的腫瘤性質(zhì)、部位 相近 。 二、移植性動物模型 移植方法 ： (1)一般要求 整個過程應(yīng)在 無菌條件下 進(jìn)行；對實體瘤應(yīng)用滅菌的手術(shù)器械切取，對腹水瘤應(yīng)用注射器抽吸； 常接種的部位：實體瘤可接種腋窩皮下，肌肉接種用大腿?。桓顾鼋臃N于腹腔。 二、移植性動物模型 （ 2）接種操作 ? 接種的基本過程 凍存的瘤株 移入宿主體內(nèi) 獲得瘤塊 （瘤源動物） 制備瘤塊 給動物接種 710d 二、移植性動物模型 A、實體瘤 ? 瘤塊接種法： 腫瘤細(xì)胞皮下接種 ——710d處死荷瘤動物 ——選擇生長良好、無壞死液化的瘤組織 ——23 mm3 + 生理鹽水或其它營養(yǎng)液 ——無菌套管針抽吸 ——接種同種受體動物 右前腋窩皮下 。 二、移植性動物模型 ? 瘤細(xì)胞懸液接種法： 接種動物較多 無菌取出瘤塊，將瘤塊剪成小塊，放入玻璃勻漿器中，加無菌生理鹽水研磨后， 經(jīng) 80100目網(wǎng)篩過濾 ，加生理鹽水稀釋成 1： 3～ 1： 4（腫瘤 g：生理鹽水 mL）的單細(xì)胞懸液，用胎盤藍(lán)染色法計數(shù)，用 1mL注射器注射到接種部位，每點接種 mL（含 1 106～ 107個細(xì)胞），每只動物可有多個接種點。 二、移植性動物模型 ? 培養(yǎng)細(xì)胞接種法： 將對數(shù)生長期細(xì)胞用 %胰蛋白酶消化脫壁后，用 PBS以 1000 r/min 離心 10 min，洗滌 2次；用胎盤藍(lán)染色計數(shù)，生理鹽水稀釋，用 1mL注射器注射到接種部位，每點接種 （含1 106～ 1 107個細(xì)胞），每只動物可有多個接種點。 二、移植性動物模型 B、腹水瘤 （ 1）抽取腹水 選擇接種后 57d的瘤源動物，脫臼致死，腹部消毒，打開腹腔，用注射器抽吸腹水，抽出的腹水。另取少量腹水，置于加有肝素的試管內(nèi)，用于細(xì)胞計數(shù)；用生理鹽水將腹水稀釋至適當(dāng)濃度，每只鼠腹腔注射 mL（含 1 106～ 1 107個細(xì)胞 )。 二、移植性動物模型 （ 一 ）兔 VX2肝癌模型 造模機制 VX2瘤株 性質(zhì)穩(wěn)定，增殖迅速，短期內(nèi)即可發(fā)生廣泛壞死，并形成肝、肺轉(zhuǎn)移，故 VX2腫瘤瘤株在大型動物模型的研究上具有很高的應(yīng)用價值。 二、移植性動物模型 造模方法 （ 1）腫瘤組織塊直接接種法 將兔子全麻后無菌條件下逐層開腹，暴露肝臟，以眼科鑷于肝左中央葉較厚處刺破肝組織并形成口小(3～ 5mm)底大 (5～ 8mm)的“ 燒瓶 ”樣竇道，將 2～ 3塊剪碎的瘤株植入其中，并以明膠海綿碎塊埋塞竇口。確認(rèn)止血后回納肝臟，逐層關(guān)腹。 （一）兔 VX2肝癌模型 術(shù)中還應(yīng)注意： (1)瘤株制備時要將壞死組織及纖維組織剔除干凈，以免影響成功率。 (2)注意無菌操作，避免感染所致接種失敗。 (3)塞入瘤株碎塊后，應(yīng)以明膠海綿填塞竇口，一來可避免瘤塊溢出造成腹腔種植；二則可使瘤株盡可能種植在肝左葉深部，可使瘤灶靠近較大血管支易于獲得血。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 2）超聲穿刺接種 采用 B超掃查待接種兔肝臟，明確兔肝位置并確定待接種部位，選定穿刺點、角度、深度。 用穿刺針芯穿刺針沿設(shè)定的穿刺角度、方向穿入預(yù)定肝位置。助手固定好穿刺針，術(shù)者拔出針芯，眼科鑷夾 1塊瘤塊放入針鞘內(nèi)，平頭穿刺針芯將瘤塊推入肝內(nèi)，重復(fù) 12次。術(shù)后預(yù)防感染。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 2）超聲穿刺接種 模型評價：采用直接穿刺法復(fù)制出的 VX2兔肝癌模型具有方法簡單、成功率高，模型性質(zhì)穩(wěn)定的特點。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 3）瘤細(xì)胞懸液經(jīng)肝包膜注入法 實驗兔術(shù)前 12h內(nèi)禁食不禁飲。常規(guī)方法暴露肝臟。挑開肝包膜，將 l mL VX2腫瘤細(xì)胞懸液用 16號針頭緩慢注人肝實質(zhì)內(nèi)，壓迫止血。避免懸液外滲引起腹腔內(nèi)種植。拔針后立即用生理鹽水棉球輕壓針眼表面至徹底止血，逐層縫合腹壁傷口。術(shù)后應(yīng)預(yù)防感染。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模方法 （ 3） 瘤細(xì)胞懸液經(jīng)肝包膜注入法 模型評價：模型損傷小，易造成彌漫性肝臟腫瘤和 腹腔種植 。 （一）兔 VX2肝癌模型 應(yīng)用 建立局限于肝內(nèi)的獨立腫瘤模型，對臨床評價各種介入治療方案的療效及抗癌藥物的篩選等具有重要意義。 （一）兔 VX2肝癌模型 造模機制 通過誘癌劑對正常大鼠誘發(fā)肝癌，且出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移如肝門淋巴結(jié)、肺轉(zhuǎn)移，應(yīng)用肝癌的原位肝移植法，可進(jìn)一步研究移植后復(fù)發(fā)的機制，為肝癌原位肝移植的臨床應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。 （ 二）肝癌原位肝移植動物模型 造模方法 給大鼠飲用含有 二乙基亞硝胺 （ DEN） 的消毒水70 d， DEN溶液每周配制 1次 ， 濃度為 %， 70 d后改為飲用普通消毒水 ， 誘癌后 140 d， 可作為 受體實施原位肝移植 。 術(shù)中要注意止血 。 術(shù)后自由飲食 ， 術(shù)后 3 d肌注氨芐西林 50 mg/d,以預(yù)防感染 。 （ 二）肝癌原位肝移植動物模型 模型特點 飲水給藥比腹腔內(nèi)給藥更為簡便 ， 誘癌時間短 ，誘癌效果確切 ， 成瘤病程較長 ， 有充足的時間觀察 。 應(yīng)用范圍 移植后腫瘤復(fù)發(fā)是肝移植治療原發(fā)性肝癌效果不佳的主要原因 ， 建立肝癌大鼠的原位肝移植模型 ， 多用于肝癌原位移植的復(fù)發(fā)機制的探討研究 。 （二）肝癌原位肝移植動物模型 造模機制 裸鼠 先天性 T淋巴細(xì)胞缺陷，可用于人體腫瘤的體內(nèi)移植。 也可用免疫抑制劑或放射線降低動物的免疫功能 (免疫抑制動物 )，在進(jìn)行移植。 （三）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ） 造模方法 選取 35周齡，體重 1820 g的裸鼠。將患者手術(shù)新鮮標(biāo)本置于 RPMI1640培養(yǎng)液中，將新鮮無壞死的癌組織切成 1 mm3小塊。 用硫噴妥鈉 30 mg/kg 腹腔注射麻醉，常規(guī)方法暴露肝臟，將切小的組織塊用穿刺針植入肝實質(zhì)內(nèi)，無菌棉簽壓迫止血，無繼續(xù)出血時將肝臟返回腹腔，關(guān)閉腹腔。術(shù)后預(yù)防感染。 （五）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ） （三）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ）模型特點 移植瘤 保留了人體原發(fā)腫瘤的形態(tài)學(xué)特點和功能 ，其細(xì)胞形狀、組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型和分化程度均保持一致，具有 分泌甲胎蛋白和癌胚抗原的功能 。 （三）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ） 應(yīng)用 裸鼠人肝癌原位移植模型具有與近似人肝癌生物學(xué)和抗癌藥物動力學(xué)特征，它應(yīng)用是研究肝癌耐藥機制的理想模型。 （三）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ） 注意事項 人肝癌原位移植于裸鼠的 不同部位其腫瘤學(xué)特性有明顯差異 。 （ 1）皮下接種法操作簡單，易于觀察，但腫瘤生長受局限，幾乎不轉(zhuǎn)移； （ 2）腹腔移植法由于位置深，難以觀察，潛伏期長，可出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶和癌性腹水。 （三）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ） 注意事項 （ 3）原位移植瘤潛伏期短，生長快，發(fā)生轉(zhuǎn)移、浸潤和腹水比例高，在研究肝癌形態(tài)學(xué)及轉(zhuǎn)移潛能方面優(yōu)于皮下途徑，尤其是腫瘤的生長部位與人肝癌相似，其微觀環(huán)境對再現(xiàn)腫瘤細(xì)胞原有的特性有明顯的影響。 （三）人肝癌原位移植動物模型（ 異種移植 ） ? 評價 : 1. 同時接種同樣量的瘤細(xì)胞，生長速度較一致，個體差異較小。 2. 接種成活率近 100%。 3. 對宿主影響相類似。 4. 可連續(xù)傳代，試驗周期短，條件易于控制。 5. 主要問題是 宿主對移植物產(chǎn)生免疫排斥反應(yīng) 。