動(dòng)物細(xì)胞制藥ppt課件-資料下載頁(yè)
2025-01-08 04:24本頁(yè)面
【正文】 將待轉(zhuǎn)化的 DNA溶液與磷脂混合，在表面活性劑的存在下形成包埋水相DNA的脂質(zhì)體結(jié)構(gòu)。 將這種脂質(zhì)體懸浮液加入到細(xì)胞培養(yǎng)液中，便會(huì)與受體細(xì)胞膜融合， DNA隨即進(jìn)入胞質(zhì)和核內(nèi)。 利用上述程序曾將外源基因成功地導(dǎo)入了小鼠的淋巴細(xì)胞和 HeLa細(xì)胞。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的物理轉(zhuǎn)化法 利用物理方法轉(zhuǎn)化高等哺乳動(dòng)物細(xì)胞的主要優(yōu)點(diǎn)是外源基因表達(dá)盒中不含任何病毒基因序列，這對(duì)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化減輕了負(fù)擔(dān)。但外源基因表達(dá)盒進(jìn)入受體細(xì)胞后，往往以多拷貝的形式隨機(jī)整合在染色體 DNA上，導(dǎo)致受體細(xì)胞基因滅活、外源基因不表達(dá)。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞的病毒轉(zhuǎn)染法 以病毒 DNA為載體可以將外源基因直接轉(zhuǎn)染特定的受體細(xì)胞。這種方法具有定向性好、實(shí)驗(yàn)重復(fù)性佳、導(dǎo)入效率高等優(yōu)點(diǎn)，但也存在一定的缺陷，如目前常用的載體宿主范圍有限，往往無(wú)法轉(zhuǎn)染一些具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值的家禽和牲畜細(xì)胞等。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)的基因擴(kuò)增現(xiàn)象 基因擴(kuò)增是外源基因在哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)高效穩(wěn)定表達(dá)的一種特殊方式。 氨甲喋呤（ MTX） 是動(dòng)物細(xì)胞中的關(guān)鍵代謝酶 二氫葉酸還原酶（ DHFR） 的特異性抑制劑，細(xì)胞培養(yǎng)物經(jīng)氨甲喋呤處理后，絕大多數(shù)細(xì)胞死亡，但在極少數(shù)幸存下來(lái)的抗性細(xì)胞中，dhfr基因均得以擴(kuò)增。這些抗性細(xì)胞正是通過(guò)增加相關(guān)基因的拷貝數(shù)、提高關(guān)鍵代謝酶的表達(dá)水平，從而抵消氨甲喋呤的抑制效應(yīng)。更重要的是，擴(kuò)增的區(qū)域遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于 dhfr基因本身，即與 dhfr基因相鄰的 DNA區(qū)域同時(shí)被擴(kuò)增。 哺乳動(dòng)物細(xì)胞高效表達(dá)外源蛋白的基本原理 通過(guò)強(qiáng)化基因擴(kuò)增高效表達(dá)外源基因 DHFRMTX高效表達(dá)系統(tǒng) 外源基因 dhfr 轉(zhuǎn)染 dhfr 細(xì)胞系 單克隆 mM MTX 培養(yǎng) 5 mM MTX mM MTX 外源基因擴(kuò)增 至 100拷貝 培養(yǎng) 單克隆 轉(zhuǎn)移 單克隆 單克隆 培養(yǎng) 培養(yǎng) 轉(zhuǎn)移 轉(zhuǎn)移 不含核苷 GSMSX高效表達(dá)系統(tǒng) 谷氨酰胺合成酶（ GS）能解除甲硫氨酸亞砜（ MSX）對(duì)動(dòng)物細(xì)胞的毒害作用。先將帶有GS編碼基因的載體轉(zhuǎn)入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，由于只有多拷貝的 GS編碼基因才能抗 MSX，所以在轉(zhuǎn)染過(guò)程中不必使用 GS缺陷型的受體細(xì)胞，而且在正常的 MSX濃度下就能篩選到含有高拷貝外源基因的轉(zhuǎn)染細(xì)胞，這是 GSMSX系統(tǒng)比DHFR MTX系統(tǒng)優(yōu)越之處。 通過(guò)強(qiáng)化基因轉(zhuǎn)錄高效表達(dá)外源基因 Ap r M13 ori ColE1 ori CMVP Polylinker Gene Intron SV40 T PolyA signal 高效表達(dá)載體 mRNA前體 AAAAAAAAA mRNA 在載體上安裝病毒或細(xì)胞來(lái)源的強(qiáng)啟動(dòng)子以及有效的翻譯元件，也是使外源基因高效表達(dá)的一種手段，如： 細(xì)胞巨化病毒 CMV的啟動(dòng)子 動(dòng)物珠蛋白基因的內(nèi)含子 SV40的終止子和 polyA化信號(hào)序列 絕大多數(shù)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的表達(dá)型載體上攜帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，因?yàn)?mRNA前體的剪切能促進(jìn)成熟 mRNA向胞質(zhì)的運(yùn)輸，有利于翻譯。有的還含有各種信號(hào)肽序列。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人源化的小鼠抗體 Neor 鼠金屬硫蛋白啟動(dòng)子 b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 抗體輕鏈 cDNA b 肌動(dòng)蛋白終止子 pL dhfr SV40啟動(dòng)子 b 肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子 抗體重鏈 cDNA b 肌動(dòng)蛋白終止子 pH 大多數(shù)惡性淋巴瘤細(xì)胞表面上都有一種特異性的糖蛋白 campath 用人源化的小鼠抗 campath抗體治療非霍金淋巴細(xì)胞瘤患者，效果良好。 重組抗體采用 DHFRMTX系統(tǒng)表達(dá)。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人組織纖溶酶原激活劑 第一個(gè)由重組哺乳動(dòng)物 dhfr 啟動(dòng)子 人 tPA cDNA 終止子 細(xì)胞規(guī)模化生產(chǎn)的醫(yī)用蛋白 是治療急性心肌梗塞的溶血 栓藥物：人組織纖溶酶原激 活劑（ tPA）。同樣采用 DHFRMTX系統(tǒng)表達(dá)，受體 細(xì)胞選用 CHO系統(tǒng)。目前， 用該工藝路線生產(chǎn)的重組人 tPA已經(jīng)商品化。 信號(hào)肽編碼序列 此外，人 tPA也可由重組大腸桿菌生產(chǎn)，但蛋白的重折疊效率低。 利用哺乳動(dòng)物工程細(xì)胞生產(chǎn)人凝血因子 VIII 凝血因子 VIII編碼基因的缺陷與血友病密切相關(guān)。多年來(lái)，血友病都是使用從人血中分離純化的凝血因子VIII制品進(jìn)行治療。然而由于人的血源污染乙肝病毒或愛(ài)滋病病毒，數(shù)千名使用這種血液制品的血友病人慘遭感染，其中 10%的病人最終死于愛(ài)滋病而非血友病。 早在上述情況發(fā)生之前，人凝血因子 VIII的 cDNA便已被克隆和鑒定，血源的污染則加速了利用基因工程技術(shù)生產(chǎn)該藥物的進(jìn)程。與 tPA相似，人凝血因子 VIII也是一種結(jié)構(gòu)復(fù)雜的大分子，必須通過(guò)重組哺乳動(dòng)物細(xì)胞生產(chǎn)，但目前商品化了的重組人凝血因子 VIII尚不能滿足幾代血友病人的大量需求。 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的研究 運(yùn)用將 DNA導(dǎo)入細(xì)胞的技術(shù)，結(jié)合從細(xì)胞中分離出細(xì)胞核并移植到去核卵母細(xì)胞中的核移植方法，把單個(gè)有功能的基因或基因簇插入到動(dòng)物的染色體中，并在其中表達(dá)，這種轉(zhuǎn)入了外源基因的動(dòng)物稱為轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 動(dòng)物克隆技術(shù) Dolly 轉(zhuǎn)基因克隆動(dòng)物技術(shù) Polly 以動(dòng)物體細(xì)胞（包括動(dòng)物成體體細(xì)胞、胎兒成纖維細(xì)胞等）為受體，將目的基因以 DNA轉(zhuǎn)染的方式導(dǎo)入能進(jìn)行傳代培養(yǎng)的動(dòng)物體細(xì)胞，再以這些體細(xì)胞為核供體進(jìn)行動(dòng)物克隆 組織工程 應(yīng)用細(xì)胞生物學(xué)和工程學(xué)的原理和方法，用少量組織細(xì)胞通過(guò)體外培養(yǎng)擴(kuò)增，構(gòu)建新的組織和器官，最終在人體實(shí)現(xiàn)無(wú)損傷修復(fù)和真正意義上的功能重建。 “人耳 ” 是由人工親手植入老鼠體內(nèi)的：先用一種高分子化學(xué)材料聚羥基乙酸做成 “ 人耳 ” 的模型支架，然后讓細(xì)胞在這個(gè)支架上繁殖生長(zhǎng)，支架最后會(huì)自己降解消失；將裸鼠的背上割開(kāi)一個(gè)口子，然后將已經(jīng)培養(yǎng)好的“ 人耳 ” 植入后縫合， “ 人耳 ”便與老鼠渾然成為一體。 思考題 名詞解釋： 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系、微載體培養(yǎng) 簡(jiǎn)述動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)特性。 什么是灌流式操作，其特點(diǎn) 是什么？
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