【正文】 度、 pH值等，就比較容易檢出和分離到。 非選擇性突變株（ nonselective mutant）： 無選擇標記（如產(chǎn)量突變型、抗原突變型、形態(tài)突變型），能鑒別這種突變體的惟一方法是檢查大量菌落并找出差異。 ? 形態(tài)突變型 —— ? 營養(yǎng)缺陷型 ——因突變而喪失產(chǎn)生某種生物合成酶的能力，并因而成為必須在培養(yǎng)基中添加某種物質(zhì)才能生長的突變類型。 ? 抗性突變型 ——因突變而產(chǎn)生了對某種化學藥物或致死物理因子的抗性 ? 條件致死突變型 ——突變后在某種條件下可正常生長繁殖，而在另一條件下卻無法生長繁殖的突變型 誘變育種 :是用誘變劑使微生物的遺傳物質(zhì) （ DNA）的分子結構發(fā)生改變 ， 進一步引起性狀變異并通過篩選獲得符合要求的變異菌株的育種方法 。 ? 誘變育種具有極其重要的實踐意義 。 當前發(fā)酵工業(yè)和其他微生物生產(chǎn)部門所使用的高產(chǎn)菌株 ， 幾乎都是通過誘變育種而明顯提高其生產(chǎn)性能的 。 第六節(jié)微生物遺傳變異的應用 一誘變育種 效價：指有效成分的濃度。 1ug/ul稱為 1 單位 從 青 霉 素 產(chǎn) 量 看 誘 變 育 種 時間 發(fā)酵單位 1943 100 1943 250 1943 500 1945 ~850 1947 ~850 1955 ~8000 1971 ~2萬 1977 ~5萬 目前 5~10萬 誘變育種的基本過程： 選擇合適的出發(fā)菌株 ↓ 制備待處理的菌懸液 ↓ 誘變處理 ↓ 篩選 ↓ 保藏和擴大試驗 出發(fā)菌株 ———用來 育種處理的 起始菌株 ◆出發(fā)菌株應具備： ①對誘變劑的敏感性高； ② 具有特定生產(chǎn)性狀的能力或潛力； ◆出發(fā)菌株的來源； ①自然界直接分離到的野生型菌株： ②歷經(jīng)生產(chǎn)考驗的菌株： ③已經(jīng)歷多次育種處理的菌株： ： (一 ) 基本原則和過程 2 處理單孢子（或單細胞）懸液 ?芽孢桿菌應處理芽孢 ?放線菌，霉菌應處理孢子 ?細菌指數(shù)期，放線菌霉菌要稍加萌發(fā)后使用 ?出發(fā)菌株應制成均勻懸夜 Cncmicro ： 誘變劑的選擇 ： ①提高突變的頻率 ②擴大產(chǎn)量變異的幅度 ③使產(chǎn)量變異朝著正突變移動 誘變劑量的選擇 ：不同種類和不同生長階段的微生物對誘變劑的敏感程度不同，所以在誘變處理前，一般應預先作誘變劑用量對菌體死亡數(shù)量的致死曲線，選擇合適的處理劑量。 誘變劑的致死率是 30%80% 選用最適劑量 劑量以誘變劑濃度和處理時間來表示 合適劑量 ： 凡在提高誘變率的基礎上，既能擴大變異幅度，又能促使變異移向正變范圍的劑量，就是合適的劑量。 Cncmicro 回變 吸入 濾紙片 保溫 可疑“三致”試樣 鼠肝勻漿 （含羥化酶） 陽性 陰性 ?經(jīng)培養(yǎng)后，出現(xiàn)三種情況：如在平板上無大量菌落產(chǎn)生，說明試樣中不含誘變劑；如在紙片周圍有一抑制圈，其外才是大量菌落，說明試樣中某誘變劑的濃度很高；如在紙片周圍即生長大量菌落，說明誘變劑的濃度合適。 4. 菌種篩選 篩選方案： ? 為了提高篩選效率，將篩選工作分為初篩和復篩兩步。 ? 初篩的目的：刪去明確不符合要求的大部分菌株，把生產(chǎn)性狀類似的菌株盡量保留下來，使優(yōu)良性狀的菌株不至于漏網(wǎng)； ——因此，初篩工作以量為主，測定的精確性還在其次；初篩手段應盡可能快速、簡單。 ? 復篩的目的：確認符合要求的菌株； ——復篩以質(zhì)為主，應精確測定每個菌株的生產(chǎn)指標。 篩選是 最為艱難的也是最為重要 的步驟 . 誘變育種的基本環(huán)節(jié) 大多死亡 少數(shù)存活 存活率 多數(shù)未變 少數(shù)突變 突變率 多數(shù)負變 少數(shù)正變 正變率 多數(shù)幅度小 少數(shù)幅度大 高產(chǎn)率 投產(chǎn)率 多數(shù)不宜投產(chǎn) 少數(shù)適宜投產(chǎn) 出發(fā)菌株 計算出 誘變 Cncmicro 以選育高產(chǎn)突變株為例，誘變育種的基本環(huán)節(jié)概括如下： 突變株的篩選方法 高產(chǎn)突變菌株的篩選方法 抗性突變體的篩選方法 營養(yǎng)缺陷型的的篩選方法 Cncmicro 與突變株的篩選相關的幾個概念 與突變株的篩選相關的幾個概念 相關培養(yǎng)基 基本培養(yǎng)基 [] 完全培養(yǎng)基 補充培養(yǎng)基 三類遺傳型 野生型 [A+B+] 營養(yǎng)缺陷型型 [A+B] 原養(yǎng)型 [A+B+] Cncmicro 突變 春日霉素產(chǎn)生 菌的孢子懸液 高產(chǎn)突變株的篩選 瓊脂塊培養(yǎng)法篩選 春日霉素高產(chǎn)菌種 含供試菌種 （拮抗對象）的瓊脂平板 抗性突變體的篩選方法 青霉素濃縮法 梯度培養(yǎng)皿法 Cncmicro 青霉素濃縮法 培養(yǎng)基 (含青霉素 ) 接入敏感菌液 （含抗性突變株） 涂布 抗青霉素菌落 培養(yǎng) 梯度培養(yǎng)皿法 強抗性 中抗性 弱抗性 含異煙肼 接敏感菌 含突變株 營養(yǎng)缺陷型的篩選辦法 中間培養(yǎng) 淘汰野生型 檢出缺陷型 夾層培養(yǎng)法 限量補充培養(yǎng)法 影印接種法 鑒定缺陷型 Cncmicro 菌絲過濾法 菌絲過濾法 篩選營養(yǎng)突變株 基本培養(yǎng)基 接入微生物孢子 （含營養(yǎng)突變株） 涂布均勻后培養(yǎng) 長出菌絲體（野生型） 菌絲過濾得 營養(yǎng)突變株 夾層培養(yǎng)法及結果 逐個檢出法 涂布 培養(yǎng) 基本培養(yǎng)基上不長菌落 完全培養(yǎng)基上長出菌落 含誘變劑的液體培養(yǎng)基 菌種 營養(yǎng)缺陷型 影印接種法 完全培養(yǎng)基 影印接種 基本培養(yǎng)基 營養(yǎng)缺陷型 限量補充培養(yǎng)法 微量蛋白質(zhì)的完全培養(yǎng)基上 小菌落是營養(yǎng)缺陷型突變株 （ degeneration） ：菌種在培養(yǎng)或保藏過程中，由于自發(fā)突變的存在，出現(xiàn)某些原有優(yōu)良生產(chǎn)性狀的劣化、遺傳標記的丟失等現(xiàn)象，稱為菌種的衰退。 2 衰退的原因 ：①基因突變，②環(huán)境條件。 3 常見的衰退現(xiàn)象： 菌落和細胞形態(tài)的改變； 生長速度緩慢，產(chǎn)孢子越來越少； 抵抗力、抗不良環(huán)境能力減弱等。 代謝產(chǎn)物生產(chǎn)能力或其對宿主寄生能力下降； 第六節(jié) 菌種的衰退、復壯及保藏 一、菌種的衰退 1 定義 : 使衰退的菌種恢復原來優(yōu)良性狀 指在菌種的生產(chǎn)性能未衰退前就有意識的進行純種的分離和生產(chǎn)性能測定工作，使菌種的生產(chǎn)性能逐步提高。 實際上是利用自發(fā)突變（正變）不斷地從生產(chǎn)中選種的過程 2 菌種的復壯措施： 1純種分離：（平板劃線法、涂布法、傾注法、單細胞挑取法）。 2淘汰已衰退的個體（采用比較激烈的理化條件進行處理，以殺死生命力較差的已衰退個體）。 3 用有效的菌種保藏方法。 二 菌種的復壯（ rejuvenation）： 1 目的 ①存活，不丟失，不污染 ②防止優(yōu)良性狀喪失 ③隨時為生產(chǎn)、科研提供優(yōu)良菌種 2. 原則： 三、菌種保藏： ?挑選典型菌種的優(yōu)良純種 一般采用微生物的休眠體（如孢子、芽孢等） ?創(chuàng)造適于微生物長時期休眠的環(huán)境條件 （如 干燥、低溫、缺氧 、避光、缺乏營養(yǎng)以及添加保護劑或酸堿中和劑等） 3 原理： 低溫、干燥、缺氧 ① 斜面保藏法 方法：菌種管置 4℃ 冰箱保藏，定時傳代 原理：低溫下，微生物代謝強度明顯下降 。 ②液體石蠟油覆蓋保藏法： 橡皮塞取代棉塞、加石蠟油。 ③ 載體保藏法 將菌種置于土壤、細紗、濾紙、硅膠等干燥材料上保藏。如砂土管法，適用于放線菌、芽孢菌和某些真菌保藏，保藏時間幾至幾十年。 ④ 冷凍干燥保藏法 加有保護劑的菌懸液在凍結狀態(tài)下予以干燥。 適用于各種微生物，便于大量保藏，菌種存活時間長，是目前最好的保藏方法。 ⑤液氮超低溫保藏法 將菌種置于保護劑中，預凍后保存在液氮超低溫冰箱中（ 196℃ ）。 適用于各種微生物的較理想的保藏方法。 ?菌種保藏機構的任務 ： 廣泛收集科研和生產(chǎn)菌種、菌株，并加以妥善保管，使之達到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。 ?菌種保藏機構 ： 中國微生物菌種保藏委員會 (CCCCM) 美國的典型菌種保藏中心 (ATCC) 英國國家典型菌種保藏所（ NCTC） 法國里昂巴斯德研究所（ IPL） 國內(nèi)外菌種保藏機構： 微生物是遺傳學研究的最好材料和對象 ?微生物結構簡單 ?營養(yǎng)體一般都是單倍體 ?微生物繁殖速度快 ?易積累不同的中間及最終代謝產(chǎn)物 ?環(huán)境條件對微生物作用直接均勻 ?存在多種方式的繁殖類型 ?微生物的變異易被識別 ?參與基因工程的載體、供體、受體 三角色