【正文】 十四）中成藥顯微鑒別要點 ? 了解組方生藥、劑型和制法 ? 根據(jù)處方明確專屬特征 第五節(jié) 理化鑒定 ? 生藥的理化鑒定 （ physical and chemical identification） 是利用 物理的或化學(xué)的 方法 ，對生藥中所含主要化學(xué)成分或有效成分進行 定性定量分析 。 ? 常用的鑒定方法有物理常數(shù)法 、 化學(xué)反應(yīng)法 、 光譜法和色譜法 。 一、物理常數(shù) ? 物理常數(shù)包括相對密度、旋光度、折光率、凝點和熔點等； 二、一般理化鑒別 ? 呈色反應(yīng) ? 沉淀反應(yīng) ? 泡沫反應(yīng)和溶血指數(shù)的測定 ? 微量升華 ? 顯微化學(xué)反應(yīng) ? 熒光分析 三、色譜法 ? 由于現(xiàn)代色譜分析技術(shù)具有 分離和分析兩種功能，即能排除復(fù)雜組分間的相互干擾，逐個將組分進行定性和定量分析，因此，現(xiàn)代色譜分析技術(shù)非常適合成分復(fù)雜的生藥的有效性評價。 ? 薄層色譜法 (thin layer chromatography, TLC) ? TLC用于鑒別、檢查或含量測定。 ? 《中國藥典》 (2022 版 ) 一部 TLC用于定性鑒別的達 1523 項，用于含量測定的為 45 項，其中有 4 種藥材采用薄層掃描法定量。 ? 氣相色譜法 (gas chromatography, GC) ? 采用氣體為流動相 流經(jīng)裝有填充劑的色譜柱進行分離測定的色譜方法。物質(zhì)或其衍生物氣化后，被載氣帶入色譜柱進行分離，各組分先后進入檢測器，用記錄儀、積分儀或數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)記錄色譜信號。 ? 《中國藥典》 (2022 版 ) 氣相色譜法用于中藥分析的品種有 47 種，其中有 4 種藥材用此法定量。另外還有兩種藥材的農(nóng)藥殘留也是用 GC 法分析 ? 高效液相色譜法 (high performance liquid chromatography, HPLC) ? HPLCUV， 無 UV吸收的皂苷類 HPLCELSD分析方法 ? 《中國藥典》 (2022 版）一部應(yīng)用高效液相色譜法測定含量的中藥品種達 479 種，涉及 518 項，其中藥材就有 98 種 。 四、分光光度法 ? 通過測定被測物質(zhì)在特定波長處或一定波長范圍內(nèi)的光吸收度 ， 對該物質(zhì)進行定性和定量分析的方法 。 ? 朗伯 比爾定律： A = ECL 式中 A 為吸收度 ； E 為吸收系數(shù)，即單位濃度、單位液層厚度的吸收度數(shù)值； C 為溶液濃度； L 為液層厚度。 ? 紫外分光光度法 ? 可見分光光度法 ? 紅外光譜法 專屬性強；標(biāo)準(zhǔn)品或標(biāo)準(zhǔn)圖譜對照；樣品純凈 ? 原子吸收分光光度法 五、其它方法 （一） NMR（ 1H， 13C, DEPT, 1H1H COSY, HMQC, HMBC, NOESY, ROESY） （二） MS（ EIMS, FABMS, ESIMS, FDMS, CIMS） （ 三）指紋圖譜 第六節(jié) DNA分子遺傳標(biāo)記鑒定 ? 以 形態(tài)學(xué) 為主的生藥鑒定方法，還不能解決所有生藥的真實性鑒定問題，特別是對同屬多來源生藥及種內(nèi)的一些變異 ( 道地藥材 ) 、動物藥等難以專屬性地鑒定。 ? 學(xué)科發(fā)展的需要以及分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使 DNA 分子遺傳標(biāo)記鑒別生藥應(yīng)運而生。 ? 生藥 DNA 分子遺傳標(biāo)記鑒定：是指通過比較生藥間 DNA 分子遺傳多樣性 差異來鑒別生藥基源，確定其學(xué)名的方法。 ? 在細胞分裂的過程中遺傳物質(zhì)由親代遺傳給子代。 ? 遺傳物質(zhì)存在于細胞核中，細胞核中的染色體是遺傳基因的載體，在由 DNA 、 RNA 和蛋白質(zhì)組成的染色體中， DNA 是絕大多數(shù)生物 的遺傳物質(zhì)。 ? DNA 分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為三類： ? 一是以電泳技術(shù)和分子雜交技術(shù)為核心的 RFLP 等技術(shù)； ? 二是以電泳技術(shù)和 PCR 技術(shù)為核心的 RAPD 、 APPCR 等 DNA 分子指紋技術(shù)和 DNA 測序技術(shù)等； ? 三是前兩類技術(shù)結(jié)合的 AFLP 、 RFLPPCR 、 RAPDPCR 和基因芯片等。 1. 限制性內(nèi)切酶酶切片段長度多態(tài)性（ RFLP， restriction fragment length polymorphism ） ? 生物在進化過程中，由于種種原因引起的基因突變和 DNA 分子結(jié)構(gòu)重排，造成了分子內(nèi)核苷酸排列順序的改變，在一處或幾處發(fā)生某種差異，當(dāng)這種改變（即使是很小的改變）涉及到限制性酶切位點時，酶切后產(chǎn)生的 DNA 片段長度將發(fā)生變化，即限制性酶譜的條帶方式將出現(xiàn)不同，產(chǎn)生多態(tài)性，稱為限制性片段長度多態(tài) 。 ? 一般應(yīng)用 Southern 雜交檢測這種多態(tài)性 ，將瓊脂糖凝膠中的 DNA 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜 （ 或其它膜 ） 上 ， 然后再用標(biāo)記的克隆基因作探針進行雜交 ， 經(jīng)放射自顯影后即可在 X 光片上看到 DNA 多態(tài)性了 。 ? 該方法試驗步驟繁瑣 ， 包括 Southern 轉(zhuǎn)移 、探針標(biāo)記 、 雜交 、 檢測等 ， 又受到探針來源的限制 ， 所需 DNA 樣品量大 （ 因沒有對 DNA 進行擴增 ） ， 僅適于 DNA 未明顯降解的新鮮材料 。 2. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (polymerase chain reaction ， PCR) ? 是 80 年代中期發(fā)展起來的體外核酸擴增技術(shù) ， 以待擴增的兩條 DNA 鏈為模板 ， 由一對人工合成的寡核苷酸作為介導(dǎo) ， 通過 DNA 聚合酶促反應(yīng) ， 在體外進行特異 DNA 序列擴增 。 ? 1. PCR 技術(shù)的基本原理 ? PCR 由 變性 退火 延伸 三個基本反應(yīng)構(gòu)成 ，重復(fù)循環(huán)變性 退火 延伸三過程 ， 就可獲得更多的 “ 半保留復(fù)制鏈 ” ， 而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板 。 每完成一個循環(huán)需 24min， 23h就能將待擴目的基因擴增放大幾百萬倍 。 ? 2. 參加 PCR 反應(yīng)的物質(zhì) ? 主要有五種即引物、酶、 dNTP 、 模板和 Mg 2+ 。 3. 隨機擴增多態(tài)性 DNA( RAPD） 和任意引物 PCR(APPCR) ? RAPD（ random amplified polymorphic DNA） 是 1990 年美國杜邦公司科學(xué)家 J. G. K. Williams 和加利福尼亞生物研究所 J. Welsh 領(lǐng)導(dǎo)的兩個小組幾乎同時發(fā)展起來的一項新技術(shù) 。 Williams 稱之為 RAPD（ random amplified polymorphic DNA ） ，Welsh 稱之為 APPCR（ arbitrary primer PCR ） 。 ? RAPD 技術(shù)建立在 PCR 技術(shù)基礎(chǔ)上 ， 它是以任意序列的寡核苷酸單鏈為引物 ， 對所研究的基因組 DNA 進行隨機擴增 。 在不同物種基因組 DNA 中 ， 這種反相重復(fù)序列的數(shù)目和間隔的長短不同 ， 就可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位點分布發(fā)生相應(yīng)的變化 ， 而使 PCR 擴增產(chǎn)物增加 、 減少或發(fā)生分子量的變化 。 通過對 PCR 產(chǎn)物的檢測和比較 ， 即可識別這些物種基因組 DNA 的多態(tài)片段 。 ? RAPD 主要有以下特點： ① 無需專門設(shè)計 RAPD 擴增反應(yīng)的引物，也無需預(yù)知被研究的生物基因組核苷酸順序，引物是隨機合成或是任意選定的。② 每個 RAPD 反應(yīng)中，僅加單個引物，通過引物和模板 DNA 鏈隨機配對實現(xiàn)擴增，擴增沒有特異性。 ③ 退火溫度較低，一般為 36℃ 。 ④ 較之常規(guī) PCR ， RAPD 反應(yīng)易于程序化。 4. PCR 擴增的特定片段的限制性位點分析（ PCRRFLP ） ? PCRRFLP 是在 PCR 和 DNA 序列分析基礎(chǔ)上產(chǎn)生的 RFLP 技術(shù)。該方法是通過 PCR 擴增一段 DNA 片段，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，消化 PCR 產(chǎn)物，經(jīng)電泳，可得到有種屬特異性的電泳譜帶，從而達到品種鑒定的目的。例如該方法在貝母類、人參類和術(shù)類藥材鑒定中應(yīng)用。 5. DNA 測序法 （ DNA Sequencing） ? DNA 直接測序技術(shù)是以 PCR 擴增引物作為測序引物 ， 采用循環(huán)測序法對 PCR 擴增的雙鏈 DNA 進行直接測序 。 ? 生藥的 DNA 測序 鑒定 就是運用 DNA 測序技術(shù)建立正品藥材及相關(guān)混偽品的原動植物的基因序列數(shù)據(jù)庫，用同樣的方法對待檢測樣品進行測序，對照數(shù)據(jù)庫即可鑒定出中藥材的真?zhèn)?