【導(dǎo)讀】從高等動植物到簡單的病毒都含有核酸，變異等生命過程中起著極為重要的作用。分子遺傳學(xué)和生物工程奠定了基礎(chǔ)。功，極大地推動了核酸的研究工作。本章主要介紹DNA和染色體的結(jié)構(gòu)。二級結(jié)構(gòu)是指在核酸中由部分。的穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)。多核苷酸鏈即為DNA的一級結(jié)構(gòu)。磷酸二酯鍵相連，形成戊糖-磷酸骨架，這樣，核酸大分子或多核。3′-OH基叫3′端。在書寫時(shí)習(xí)慣上把5′端放在左邊，5′pACGT3′表示脫氧多核苷酸的結(jié)構(gòu)。復(fù)性快慢分為三類。300bp，多數(shù)為5～15bp。復(fù)單位組成的重復(fù)序列。具有種屬特異性。高度重復(fù)序列可能參。均長度6×105bp，平均重復(fù)350次。的區(qū)域，有些則與單拷貝序列間隔排列；列不編碼蛋白質(zhì)。傳信息，也有一些是基因間隔序列。信息功能，即基因啟動和關(guān)閉。旋圈上升10對核苷酸，螺距為nm。鍵，從而抵消負(fù)電荷之間的排斥作用。白質(zhì)因子間的相互識別和結(jié)合來實(shí)現(xiàn)的。旋的截面，大于180º的一側(cè)表示大溝，在大溝中裸露的是堿基對。當(dāng)然，這并不意味著小溝對

　　

【正文】 它物理方法 ， 將凝膠中的單鏈 DNA分子轉(zhuǎn)移并固定到固相支持物表面上 （ 一般為硝酸纖維素膜或尼龍膜 ） ， 此時(shí)的 DNA片段還保留著原來 譜帶的模式。此時(shí)用核酸探針與膜上的 DNA片段雜交，那么，與探針有同源性的 DNA片段在膜上的位置便可通過放射自顯影被檢測出來（圖 229）。此法靈敏度很高，可以檢測出僅含 2ng的 DNA電泳條 帶。它幾乎可以同時(shí)用于構(gòu)建 DNA分子的酶切圖譜和遺傳圖。 圖 229 Southern分子雜交技術(shù)用于檢測特異 DNA 序列的存在 （二） Northern 印跡雜交（ Northern bloting） 這種方法由于與 Southern印跡雜交技術(shù)十分類似而得名 。 所不同的是： Northern印跡雜交是將 RNA分子從凝膠轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜或其它化學(xué)修飾的活性濾紙上 ，從而進(jìn)行核酸雜交的一種實(shí)驗(yàn)方法 。 此法因測定的是細(xì)胞的總 RNA或 mRNA， 所以操作時(shí)需注意： （ 1） RNA極易被環(huán)境中存在的 RNA酶系所降解 ， 因此在提取 過程中應(yīng)謹(jǐn)防 RNA酶的污染 ， （ 2） 為保持RNA電泳時(shí)呈單鏈線形狀態(tài) ， 防止其形成發(fā)夾式二級結(jié)構(gòu) ， 瓊脂糖凝膠電泳時(shí)需在變性劑 （ 乙二醛或甲醛 、 甲基氫氧化汞 ） 的存在下進(jìn)行 。 （ 3） 印跡前須將變性劑用水沖洗去掉 。 （ 三 ） 斑點(diǎn)雜交 （ dot blotting） 斑點(diǎn)雜交是在 Southern 印跡雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展而來的快速檢測特異核酸 （ DNA或RNA） 分子的雜交技術(shù) 。 操作是通過抽 真空的方式將加在多孔過濾進(jìn)樣器上的核酸樣品 ， 直接轉(zhuǎn)移到適當(dāng)?shù)碾s交濾膜上 ，然后按如同 Southern或 Northern 印跡雜交一樣的方式同核酸探針分子進(jìn)行雜交 。因加樣時(shí)使用了特殊設(shè)計(jì)的加樣裝置 ，使眾多待測的核酸樣品能夠一次同步轉(zhuǎn)移到雜交濾膜上 ， 并有規(guī)律地排列成點(diǎn)陣 ， 因此稱為斑點(diǎn)印跡雜交 。 此法更適用于核酸樣品的定量檢測 。 而不是定性檢測 。 可通過掃描儀掃描斑點(diǎn)的放射性脈沖數(shù) ， 來確定樣品中 RNA或 DNA分子的相對含量 。 （四）原位雜交（ in situ hybridization） 組織原位雜交簡稱原位雜交 ， 是在細(xì)胞保持基本形態(tài)的情況下將探針注入細(xì)胞內(nèi)與 RNA或 DNA雜交 ， 雜交反應(yīng)在載物片上的細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行 。 其基本步驟是通過適當(dāng)處理使細(xì)胞通透性增加 ， 探針進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)與 DNA或 RNA雜交 、 沖洗等 。 用放射自顯影或免疫酶法顯示雜交結(jié)果 。 用于原位雜交的探針可以是單鏈或雙鏈 DNA和 RNA探針。所用的探針要短，才能盡量使探針摻入細(xì)胞內(nèi)。一般用具 50～300bp長度的探針較合適。新近研究表明，人工合成的 16～ 30bp的寡核苷酸短鏈能自由進(jìn)出組織細(xì)胞壁，雜交效率也高，是原位雜交的優(yōu)良探針。探針的標(biāo)記物可以是放射性同位素，也可以是非放射性生物和半抗原等。 原位雜交可以用來確定探針的互補(bǔ)序列在 細(xì)胞內(nèi)的空間位置 ， 用標(biāo)記的探針與細(xì)胞分裂中期染色體 DNA雜交以研究染色質(zhì)中特定核酸序列 ， 與細(xì)胞 RNA的雜交可精確分析任何一種 RNA在細(xì)胞和組織中的分布和特定基因表達(dá)水平 。 原位雜交是一種發(fā)展極為迅速的新技術(shù) ，但敏感性 、 特異性和穩(wěn)定性仍需進(jìn)一步完善和提高 。 第五節(jié) DNA序列分析及進(jìn)展 遺傳信息儲存在 DNA分子一級結(jié)構(gòu)的核苷酸序列中，特定的序列表達(dá)的信息是什么？首要的任務(wù)是序列測定。人類基因組基本框架已經(jīng)建立，并期望盡快弄清全部基因組序列，以便掌握人類生、老、病、死的奧秘。因此， DNA序列分析技術(shù)與方法，當(dāng)之無愧成為揭開生命之秘的一把金鑰匙。它對于從分子水平 研究基因結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系以及克隆 DNA片段，都具有廣泛的實(shí)用價(jià)值。 二十世紀(jì) 60年代以前，由于分離分析技術(shù)和研究方法上的限制， DNA序列分析進(jìn)展比較緩慢。為了使 DNA核苷酸序列分析成可能，著名華裔生物化學(xué)及分子生物學(xué)家吳瑞士，在 1968年獨(dú)巨匠心地設(shè)計(jì)出一種嶄新的引物 延伸測序策略，開創(chuàng)性的建立了 DNA序列測定的新方法，并于1971年首次成功地測定了 λ 噬菌體兩個(gè) 粘性末端的完整序列。之后， 他的引物 延伸策略基礎(chǔ)上，發(fā)明了快速測定 DNA序列的末端終止法； 納了 ，完善了聚合酶鏈反應(yīng)（ PCR）擴(kuò)增 DNA的方法； ，發(fā)明了堿基定點(diǎn)突變技術(shù)。這三位科學(xué)家獨(dú)到的研究成果和方法的啟迪性顯為人知，先后榮登諾貝爾領(lǐng)獎臺。由于技術(shù)方法的建立，許多基因的 DNA序列測定進(jìn)展順利。已測核苷酸 序列所包含的信息被科學(xué)家們廣泛地用于醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)和工業(yè)在內(nèi)的生物學(xué)的各個(gè)領(lǐng)域。已經(jīng)和即將對人類帶來更多福音。 一 、 Sanger法 1． Sanger雙脫氧末端終止法基本原理 劍橋大學(xué)著名生物化學(xué)家 1977年發(fā)明的一種簡單快速 DNA序列測定新方法，該方法要求的基本條件是：①選取高純度的待測單鏈 DNA作模板；②供給 5’標(biāo)記的短鏈 DNA引物和 dNTP底物；③具有 熱穩(wěn)定性好、活性高的 DNA聚合酶 如Kelenow片段或 Taq酶等）；④尤其需要加入可隨機(jī)終止鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)的試劑 2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ ddNTP）。 ddNTP與 dNTP結(jié)構(gòu)區(qū)別見圖 232。 ：①把待測 DNA樣品分出四份，分別置于編號試管；②加入底物 dNTP、聚合酶、 5’被放射性標(biāo)記的 DNA引物；③給各試管分別加入一種 ddNTP；④保溫反應(yīng)后，從各管 分別取樣，并在同一塊凝膠上進(jìn)行 PAGE分離、放射性自顯影；⑤根據(jù)顯帶拼讀堿基序列。 試管反應(yīng)液中如果加入 ddNTP的是 ddATP（如圖 233中的第 1號試管），聚合酶在鏈?zhǔn)骄酆戏磻?yīng)過程中的某一次反應(yīng)，會在標(biāo)記的引物新生鏈 3’OH上，根據(jù)模板（ T）的要求摻入 ddAMP。一旦摻入 ddAMP后，由于其 3’端無游離的 OH，因此該標(biāo)記的新生鏈的延伸即告終止。因?yàn)榉磻?yīng)摻入 ddAMP是隨機(jī)的，結(jié)果會在反應(yīng)液中存在以 ddAMP為結(jié)尾的各種長度的新生 DNA片段。其它試管則類似存在以 ddCMP、ddGMP、 ddTMP結(jié)尾的各種長度的片段。四種反應(yīng)液分別作樣品，在同一膠面上進(jìn)行 PAGE電泳分離。由于 PAGE方法有很高的分辯率，即使相差一個(gè)單核苷酸的標(biāo)記片段也能使之分開。最后通過放射性自顯影術(shù)顯帶后，便可以讀出待測 DNA核苷酸順序。通過 ，有經(jīng)驗(yàn)的工作者可以測定 含有 200～ 300核苷酸 的 DNA順序。有關(guān)測定原理見圖 233。 雙脫氧法的特點(diǎn)是需要單鏈模板、寡核苷酸引物和高質(zhì)量的 DNA聚合酶。該方法的優(yōu)點(diǎn)是簡單、快速。缺點(diǎn)是①聚合反應(yīng)會因?yàn)槎壗Y(jié)構(gòu)而提前終止，常常測不到準(zhǔn)確的 DNA序列；②由于需要經(jīng)模板與引物結(jié)合后，才能反應(yīng)并測序，因此對于寡聚核苷酸 DNA序列，例如對引物 DNA的序列不能測定。③該法直接分析的是合成 的新鏈序列，而不是模板鏈，因此不能分析模板中甲基化部位；④需要適當(dāng)?shù)囊锖湍芎铣蓡捂溎０宓妮d體。 5’GATGCATCTCTAAT3’ ddAGATTA32P5’ ddAGAGATTA32P5’ ddACGTAGAGATTA32P5’ CTACGTAGAGATTA32P5’ 加入各種反應(yīng)試劑 聚合時(shí)隨機(jī)摻入新鏈3’端；本身3’無OH會使鏈延長反應(yīng)終止。 5’GATGCATCTCTAAT3’待測DNA ddGATTA32P5’ ddGAGATTA32P5’ ddGAGAGATTA32P5’ CTACGTAGAGATTA32P 5’ 電泳 Ⅳ 管反應(yīng)結(jié)果 Ⅰ 管反應(yīng)結(jié)果