【正文】 g A,B: 24h for 100181。mol Drug B,A+B: 24h) treated HepG2 cells at 24 h. Density of each protein band was detected through Bandscan software (Glyko, Novato, CA, USA). 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實驗部分 15 第三章 結(jié)論與討論 結(jié)論 Drug A 和 Drug B 單獨處理 HepG2 細胞，增值抑制程度表現(xiàn)為時間劑量 依賴效應(yīng)。 A 6μmol/L聯(lián)合 Drug B 100μmol/L協(xié)同作用 24h 最為顯著。 ，聯(lián)合用藥組凋亡率升高更為明顯。 ， Drug A 與 Drug B 聯(lián)合用藥 24h后的 pERK 蛋白的表達明顯被抑制，但 ERK 蛋白表達無明顯變化。 討論 本論文對 Drug A聯(lián)合 Drug B對人肝癌 HepG2細胞作用機制進行了探討。有絲分裂原激活蛋白激酶（ mitogenactivated protein kinases， MAPKs）是哺乳動物細胞內(nèi)廣泛存在的一組絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，對細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起到重要的調(diào)節(jié)作用。 MAPK 途徑主要由三種激酶組成： MAP激酶（ MAPK）， MAPK 激酶（ MAPKK）與 MAPKK激酶（ MAPKKK）。 MAPKKK對 MAPKK的絲 蘇氨酸雙位點磷酸化而將其活化； MAPKK對 MAPK 絲蘇氨酸雙位點磷酸化而活化。它們參與細胞生長、發(fā)育及分化等多種生理過程，并在細胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過程中起重要作用 [7]。 眾所周知，所有真核細胞中均存在 RAF/MEK/ERK級聯(lián)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其通過 Ras、 Raf、MEK及 ERK的特異性級聯(lián)磷酸化將信號由細胞膜外傳入細胞核內(nèi) [8]。在 Raf激酶的作用下，激活的 MEK將磷酸化 ERK。而被磷酸化激活的 ERK轉(zhuǎn)移至細胞核，并且通過磷酸化作用，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)節(jié)包括多種參與細胞增殖、存活和分化的基因表達 [9]。該通路上的相關(guān)蛋白發(fā)生突變或過度激活，都將導(dǎo)致細胞增殖的加速與細胞生存期的延長，促進腫瘤的形成及發(fā)展 [10]。 Drug A與 Drug B聯(lián)合用藥 24h后的 pERK蛋白的表達明顯被抑制，從而起到殺傷 HepG2細胞，誘導(dǎo)細胞發(fā)生凋亡。細胞凋亡 (apoptosis)是受基因調(diào)控的生理性、自主性細胞死亡過程，細胞凋亡有其自身特點，首先凋亡細胞在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)凝縮， DNA大規(guī)模斷片化，細胞膜內(nèi)陷并發(fā)泡形成凋亡小體，但細胞膜的完整性未被破壞 。其次細胞凋亡過程消耗 ATP。本研究結(jié)果顯示，電鏡 觀察的結(jié)果證實了凋亡特征性的形態(tài)變化。流式細胞儀檢測結(jié)果不但證實了凋亡存在，而且比較了各組的凋亡發(fā)生程度，聯(lián)合用藥組細胞凋亡率高于兩單藥組。但是本實驗研究只是從 RAF/MEK/ERK這一條通路進行的機制研究，并且并沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實驗部分 16 沒有考察其他凋亡相關(guān)蛋白的表達。線粒體可以決定細胞的生存或死亡 [11,12]，接下來我們可以考察兩藥合用是否影響 BclxL， Bcl2,Bax,，從而促進細胞凋亡 [13,14]。 除了對凋亡蛋白的考察外，還可以影響細胞周期。 Drug A經(jīng)過不同的細 胞周期阻滯機制，使腫瘤細胞阻滯在 G0期，細胞增殖受阻，誘導(dǎo)凋亡。聯(lián)合二者是否在更大程度上阻斷細胞周期進展，起到增強抗腫瘤效果也是值得考察的重點。 Drug A與 Drug B聯(lián)合用藥是否對 HepG2細胞具有特異性的協(xié)同作用也需要考察，也就是說，我們還需考察的其他的腫瘤細胞。整體實驗需建立肝癌細胞小鼠皮下移植瘤模型，隨機分組，空白對照組、 Drug A組、 Drug B組、聯(lián)合用藥組，觀察移植瘤生長情況。實驗結(jié)果若為聯(lián)合用藥作用于其他腫瘤細胞仍可起到良好的協(xié)同作用并且兩藥合用整體實驗中與單獨給藥組比較抑瘤作用增 強的話，聯(lián)合給藥對臨床應(yīng)用具有更為重要的意義。 沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實驗部分 17 參考文獻 [1] 崔彥芝 ．多靶點藥物聯(lián)合順鉑對肝癌細胞的作用及機制研究． 南方醫(yī)科大學(xué)， 2021。 [2] 黃海華，余立華等 ． 藥學(xué)細胞生物學(xué) [M] ． 北京：中國醫(yī)藥科技出版社， 2021年（ 2）， 454455。 [3] 李曉丹，李進 ． 細胞凋亡 [J]． 國外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊 ， 1997, 17 (3)， 231233。 [4] 劉因華 ． 抗腫瘤藥物的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景 [J] ．中國醫(yī)藥指南， 2021年 9月上半月刊， 106。 [5] Suzuki K, Hino M, Kutsuna H, Hato F, Sakamoto C, Takahashi T. Selective activation of p38 mitogenactivated protein kinase cascade in human eutrophils stimulated by IL1β . J Immol Lunol 2021, 167: 59405947. [6] Sambrook J, Fritsch EF, ManiatisT. Molecular cloning: A Laboratory Manual 2nd ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989, 880898. [7] Lewis TS, Shapiro PS, Ahn NG. Signal transduction through MAP kinase cascades. Adv Cancer Res, 1998。 74:49 139. [8] Kolch W. Meaningful relationships: the regulation of the Ras/Raf/MEK/ERK pathway by protein interactions. Biochem J, 2021。351(Pt 2):289305. [9] Roberts PJ, Der CJ: Targeting the RafMEKERK mitogenactivated Protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene2021， 26(22):32913310. [10] McCubrey JA， Steelman LS， Abrams SL， Lee JT， Chang F， Bertrand FE， Navolanic PM， Terrian DM, Franklin RA,D Assoro AB et al: Roles of the transformation and drug resistance. 2021， 46:249279. [11] Adrain C， Martin SJ. The mitochondrial apoptosome: a killer unleashed by the cytochrome seas[J].Trends Biochem Sci， 2021， 26(6):290 297. [12] Vande VC， Cizeau J， Dubik and geic control of necrosislike cell death through the mitochondrial permeability transition pore[J].Mol Cell Biol， 2021， 20(15):54545468. [13] Cory S, Adams JM. The Bcl2 family: regulators of the cellular lifeordeath switch. Nat Rev Cancer, 2021。2(9):647656. [14] Harris MH, Thompson CB .The role of the Bcl2 family in the regulation of outer mitochondrial membrane permeability. Cell Death Differ, 2021。7(12):1182119沈陽藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 結(jié)束語（致謝） 18 致謝 本實驗是在池島 喬教授和夏明鈺副教授的悉心指導(dǎo)下完成的，在此對各位老師表示深深的謝意。導(dǎo)師們嚴謹?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，豐富扎實的理論知識和高度的責(zé)任感深深感染著我。在這短短的幾個月里，我所學(xué)到的理論知識、實驗技能、研究思路，及端正的實驗態(tài)度讓我受益匪淺，將對我的以后的道路起到重要的指導(dǎo)作用。在此，謹對導(dǎo)師們的辛勤培育和熱情關(guān)懷致以最衷心的感謝。 在實驗過程中， 鄭楠師姐 對我要求嚴格，使我掌握了更多的知識和實驗技能；在論文完成過程中， 鄭楠 學(xué)姐又給予我熱心指導(dǎo)和幫助，使 我的論文能夠更加順利完成，在此表示最誠摯的謝意。此外，感謝 本實驗室 其他師兄師姐及各同期專題生同學(xué)給予我的照顧與幫助。 最后，對精心審閱論文的各位老師致以最誠摯的謝意！并感謝答辯委員會各位老師的不吝賜教！