【正文】 g A,B: 24h for 100181。mol Drug B,A+B: 24h) treated HepG2 cells at 24 h. Density of each protein band was detected through Bandscan software (Glyko, Novato, CA, USA). 沈陽(yáng)藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 15 第三章 結(jié)論與討論 結(jié)論 Drug A 和 Drug B 單獨(dú)處理 HepG2 細(xì)胞，增值抑制程度表現(xiàn)為時(shí)間劑量 依賴(lài)效應(yīng)。 A 6μmol/L聯(lián)合 Drug B 100μmol/L協(xié)同作用 24h 最為顯著。 ，聯(lián)合用藥組凋亡率升高更為明顯。 ， Drug A 與 Drug B 聯(lián)合用藥 24h后的 pERK 蛋白的表達(dá)明顯被抑制，但 ERK 蛋白表達(dá)無(wú)明顯變化。 討論 本論文對(duì) Drug A聯(lián)合 Drug B對(duì)人肝癌 HepG2細(xì)胞作用機(jī)制進(jìn)行了探討。有絲分裂原激活蛋白激酶（ mitogenactivated protein kinases， MAPKs）是哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的一組絲氨酸 / 蘇氨酸蛋白激酶，對(duì)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起到重要的調(diào)節(jié)作用。 MAPK 途徑主要由三種激酶組成： MAP激酶（ MAPK）， MAPK 激酶（ MAPKK）與 MAPKK激酶（ MAPKKK）。 MAPKKK對(duì) MAPKK的絲 蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化而將其活化； MAPKK對(duì) MAPK 絲蘇氨酸雙位點(diǎn)磷酸化而活化。它們參與細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分化等多種生理過(guò)程，并在細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化等病理過(guò)程中起重要作用 [7]。 眾所周知，所有真核細(xì)胞中均存在 RAF/MEK/ERK級(jí)聯(lián)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，其通過(guò) Ras、 Raf、MEK及 ERK的特異性級(jí)聯(lián)磷酸化將信號(hào)由細(xì)胞膜外傳入細(xì)胞核內(nèi) [8]。在 Raf激酶的作用下，激活的 MEK將磷酸化 ERK。而被磷酸化激活的 ERK轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核，并且通過(guò)磷酸化作用，激活多種轉(zhuǎn)錄因子，最終調(diào)節(jié)包括多種參與細(xì)胞增殖、存活和分化的基因表達(dá) [9]。該通路上的相關(guān)蛋白發(fā)生突變或過(guò)度激活，都將導(dǎo)致細(xì)胞增殖的加速與細(xì)胞生存期的延長(zhǎng)，促進(jìn)腫瘤的形成及發(fā)展 [10]。 Drug A與 Drug B聯(lián)合用藥 24h后的 pERK蛋白的表達(dá)明顯被抑制，從而起到殺傷 HepG2細(xì)胞，誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生凋亡。細(xì)胞凋亡 (apoptosis)是受基因調(diào)控的生理性、自主性細(xì)胞死亡過(guò)程，細(xì)胞凋亡有其自身特點(diǎn)，首先凋亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)上主要表現(xiàn)為胞質(zhì)濃縮，核染色質(zhì)凝縮， DNA大規(guī)模斷片化，細(xì)胞膜內(nèi)陷并發(fā)泡形成凋亡小體，但細(xì)胞膜的完整性未被破壞 。其次細(xì)胞凋亡過(guò)程消耗 ATP。本研究結(jié)果顯示，電鏡 觀察的結(jié)果證實(shí)了凋亡特征性的形態(tài)變化。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果不但證實(shí)了凋亡存在，而且比較了各組的凋亡發(fā)生程度，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率高于兩單藥組。但是本實(shí)驗(yàn)研究只是從 RAF/MEK/ERK這一條通路進(jìn)行的機(jī)制研究，并且并沈陽(yáng)藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 16 沒(méi)有考察其他凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)。線粒體可以決定細(xì)胞的生存或死亡 [11,12]，接下來(lái)我們可以考察兩藥合用是否影響 BclxL， Bcl2,Bax,，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡 [13,14]。 除了對(duì)凋亡蛋白的考察外，還可以影響細(xì)胞周期。 Drug A經(jīng)過(guò)不同的細(xì) 胞周期阻滯機(jī)制，使腫瘤細(xì)胞阻滯在 G0期，細(xì)胞增殖受阻，誘導(dǎo)凋亡。聯(lián)合二者是否在更大程度上阻斷細(xì)胞周期進(jìn)展，起到增強(qiáng)抗腫瘤效果也是值得考察的重點(diǎn)。 Drug A與 Drug B聯(lián)合用藥是否對(duì) HepG2細(xì)胞具有特異性的協(xié)同作用也需要考察，也就是說(shuō)，我們還需考察的其他的腫瘤細(xì)胞。整體實(shí)驗(yàn)需建立肝癌細(xì)胞小鼠皮下移植瘤模型，隨機(jī)分組，空白對(duì)照組、 Drug A組、 Drug B組、聯(lián)合用藥組，觀察移植瘤生長(zhǎng)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果若為聯(lián)合用藥作用于其他腫瘤細(xì)胞仍可起到良好的協(xié)同作用并且兩藥合用整體實(shí)驗(yàn)中與單獨(dú)給藥組比較抑瘤作用增 強(qiáng)的話，聯(lián)合給藥對(duì)臨床應(yīng)用具有更為重要的意義。 沈陽(yáng)藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 第二章 實(shí)驗(yàn)部分 17 參考文獻(xiàn) [1] 崔彥芝 ．多靶點(diǎn)藥物聯(lián)合順鉑對(duì)肝癌細(xì)胞的作用及機(jī)制研究． 南方醫(yī)科大學(xué)， 2021。 [2] 黃海華，余立華等 ． 藥學(xué)細(xì)胞生物學(xué) [M] ． 北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社， 2021年（ 2）， 454455。 [3] 李曉丹，李進(jìn) ． 細(xì)胞凋亡 [J]． 國(guó)外醫(yī)學(xué)生理、病理科學(xué)與臨床分冊(cè) ， 1997, 17 (3)， 231233。 [4] 劉因華 ． 抗腫瘤藥物的研究現(xiàn)狀與發(fā)展前景 [J] ．中國(guó)醫(yī)藥指南， 2021年 9月上半月刊， 106。 [5] Suzuki K, Hino M, Kutsuna H, Hato F, Sakamoto C, Takahashi T. 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Cell Death Differ, 2021。7(12):1182119沈陽(yáng)藥科大學(xué)本科畢業(yè)論文 結(jié)束語(yǔ)（致謝） 18 致謝 本實(shí)驗(yàn)是在池島 喬教授和夏明鈺副教授的悉心指導(dǎo)下完成的，在此對(duì)各位老師表示深深的謝意。導(dǎo)師們嚴(yán)謹(jǐn)?shù)闹螌W(xué)態(tài)度，豐富扎實(shí)的理論知識(shí)和高度的責(zé)任感深深感染著我。在這短短的幾個(gè)月里，我所學(xué)到的理論知識(shí)、實(shí)驗(yàn)技能、研究思路，及端正的實(shí)驗(yàn)態(tài)度讓我受益匪淺，將對(duì)我的以后的道路起到重要的指導(dǎo)作用。在此，謹(jǐn)對(duì)導(dǎo)師們的辛勤培育和熱情關(guān)懷致以最衷心的感謝。 在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中， 鄭楠師姐 對(duì)我要求嚴(yán)格，使我掌握了更多的知識(shí)和實(shí)驗(yàn)技能；在論文完成過(guò)程中， 鄭楠 學(xué)姐又給予我熱心指導(dǎo)和幫助，使 我的論文能夠更加順利完成，在此表示最誠(chéng)摯的謝意。此外，感謝 本實(shí)驗(yàn)室 其他師兄師姐及各同期專(zhuān)題生同學(xué)給予我的照顧與幫助。 最后，對(duì)精心審閱論文的各位老師致以最誠(chéng)摯的謝意！并感謝答辯委員會(huì)各位老師的不吝賜教！