【正文】 培養(yǎng)基中添加蝸牛酶可以提高纖維素酶的分泌量 (張培 德等， 2021)。 Romero 等(1999)以粗糙鏈抱霉 (Neurospora crassa)為菌種，將麥桿磨碎過篩作為主要碳源，研究了麥桿濃度、溫度和初始 pH 對葡聚糖內(nèi)切酶、葡聚糖外切酶和 223。 一葡萄糖昔酶活性的影響，同時對胞外和菌體中蛋白質(zhì)含量也進(jìn)行了觀察，發(fā)現(xiàn)菌體生長和產(chǎn)酶的培養(yǎng)條件不同，在培養(yǎng)基中加入蛋白酶抑制劑，可以避免纖維素酶在發(fā)酵過程中的較大波動。 Domingues 等 (2021)研究了里氏木霉 RutC30 在液體搖瓶培養(yǎng)時的形態(tài)，也探討了培養(yǎng)基組成和接種量對菌絲形態(tài)和纖維素酶產(chǎn)量的影響。Svetlana Velkovska 等研究了里氏木霉 Rut C30 生產(chǎn)纖維素酶的條件，并建立了纖維素酶分批發(fā)酵的動力學(xué)模型 (Svetlana Velkovska et al. ,1997)。有人采用里氏木霉作為發(fā)酵菌株，以經(jīng)過爆汽處理的柳木為主要碳源，分別研究了該菌在搖瓶、 4L和 22L 發(fā)酵罐中的產(chǎn)酶情況 (Reczey et al. , 1996 )。韓峰等以擬康氏木霉( Trichoderma pseudokoningii )為生產(chǎn)菌株，經(jīng)誘變后液體發(fā)酵，得到了較高的酶活力 (韓峰等， 2021)。張德強(qiáng)等采用綠色木 霉液體發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，研究了培養(yǎng)基組成、培養(yǎng)條件對產(chǎn)酶的影響 (張德強(qiáng)等， 2021)。王冬等 (1995)研究了 L 一山梨糖提高木霉纖維素酶合成速率機(jī)制，認(rèn)為其主要機(jī)制不是阻礙細(xì)胞壁的正常合成，促進(jìn)了酶的分泌，而是通過降低了菌絲體的生長速率來起作用。干冬等 (1996)以蟲熒光素酶法檢驗(yàn)了四株絲狀真菌在葡萄糖一無機(jī)鹽液體培養(yǎng)過程中的胞內(nèi) ATP 含量，結(jié)果表明 :只有當(dāng)胞內(nèi) ATP 濃度低于 10mg/mL 時，真菌才開始合成胞外纖維素酶 。以不同濃度的各種碳源培養(yǎng)時，菌體胞內(nèi) ATP 含量只要超過 1 了 mg/mL, FPA的合成即發(fā) 生阻遏，菌體胞內(nèi) ATP 含量與 FPA 合成呈顯著負(fù)相關(guān) 。以高效液相色譜(HPLC)法檢測了菌體培養(yǎng)液中的。 AMP 含量，在非阻遏條件下，外源 cAMP 可以提高 FPA 的合成水平，但外源 cAMP 不能解除己經(jīng)發(fā)生的酶合成阻遏，菌體 ATP和 cAMP 水平是調(diào)節(jié)真菌纖維素酶合成的重要因子。 中國礦業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 15 頁 固定化酶和細(xì)胞 除固體發(fā)酵和深層液體發(fā)酵外，有人還對纖維素酶的固定化進(jìn)行了研究。夏黎明等 (1998)采用多孔聚酷材料固定里氏木霉 Rut C30 菌絲細(xì)胞，將固定化細(xì)胞在生長限制條件下重復(fù)分批培養(yǎng)，使纖維素酶的合成與玉米秸桿纖維原料的 酶解糖化禍合在一個反應(yīng)器中同時進(jìn)行。在 30℃ 、初始 、搖瓶轉(zhuǎn)速 150r/min 的條件下，連續(xù)重復(fù)進(jìn)行 12 次分批培養(yǎng)試驗(yàn)，每次玉米桿用量為 60g/L，培養(yǎng)周期 ，共 54 組 培養(yǎng)液中含濾紙酶活力平均為 ，還原糖 g/L，糖化率達(dá)到理論值的 %。固定化菌絲形態(tài)正常 。在間歇補(bǔ)料條件下，玉米桿原料的總量可提高， 7d 后還原糖濃 度 達(dá) g/L，糖化率為 %。這種方法將產(chǎn)酶和糖化同時進(jìn)行，工藝簡單、成本低廉、易于連續(xù)自動化操作。陳盛等 (1996)以蟹殼為原料提取 殼聚糖，用戊二醛作交聯(lián)劑，將纖維素酶固定于殼聚糖上，探討了一定量干殼聚糖載體與交聯(lián)劑濃度、給酶量等最適固定化酶條件。 Haapala 等 (1996)利用尼龍網(wǎng)固定化里氏木霉后，其所產(chǎn)的內(nèi) 切 葡聚糖酶和木聚糖酶活性均高于游離菌絲 。當(dāng)以乳糖、纖維素和山梨糖為碳源時，氮源顯著影響這兩種酶活性。 目前國內(nèi)的有關(guān)情況 國內(nèi)的 需求情況 21 世紀(jì)被稱為生物技術(shù)的世紀(jì)，國家十分重視生物技術(shù)工程在工農(nóng)業(yè)方面的應(yīng)用。根據(jù)市場調(diào)查和研究分析，纖維素酶的應(yīng)用，不但能夠提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，而且可大大地降低生產(chǎn)成本，該產(chǎn)品的 生產(chǎn)彌補(bǔ)了國內(nèi)市場缺口，因此具有較大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景。 我國的飼養(yǎng)業(yè)在農(nóng)業(yè)中占舉足輕重的地位，近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，對肉、蛋、奶的需求量越來越大，飼養(yǎng)業(yè)的發(fā)展，對飼料添加劑的需求量必然會急劇上升。纖維素酶作為飼料添加劑，可使飼料的消化率從 50%60%提高到 80%以上，按我國年產(chǎn)飼料 5000 萬噸計，以 1‰的加入量，需求量有 5 萬噸以上。在釀酒過程中加入纖維素酶，既提高了產(chǎn)品質(zhì)量，又可提高產(chǎn)量，節(jié)約大量糧食，釀酒業(yè)年需求量在千噸以上。由于紡織業(yè)的發(fā)展和改革，纖維素酶的應(yīng)用也越 來越廣泛，僅水洗布生產(chǎn)一項(xiàng)，國內(nèi)每年需求在 600 噸以上。 纖維素酶已廣泛應(yīng)用于棉紡織品（牛仔服、西服等）的水洗整理，可以取代浮石，獲得優(yōu)質(zhì)花斑和懸垂度；纖維素酶還可作為飼料添加酶，增加動物（牛、豬、雞等）的消化代謝功能。此外，該酶制劑還被廣泛用于果汁加工、釀造等領(lǐng)域，市場潛力很大。采用液體深層發(fā)酵工藝（ 30m3發(fā)酵罐）和固態(tài)發(fā)酵工藝（ 1噸 /天）生產(chǎn)纖維素酶的技術(shù)已通過省級鑒定，現(xiàn)已用于工業(yè)化生產(chǎn)，并獲得了良好經(jīng)濟(jì)效益。經(jīng)噴霧干燥制備的酶粉目前售價 10 萬 /噸，成本約 萬 /噸；經(jīng)固態(tài)發(fā)酵制成的粗酶 粉，作為飼料添加酶，目前售價 3～ 4 萬 /噸，而成本大約 2021～4000 元 /噸，利潤十分豐厚。 主要技術(shù)指標(biāo) 中國礦業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 16 頁 菌株發(fā)酵產(chǎn)酶能力： CX酶： 4001400u/ml/h 1u 相當(dāng)于每小時毫克葡萄糖： C1酶 60230u/ml/(24h) 葡萄糖苷酶 516 u/ml/h Fp 酶： 2054 u/ml/h 產(chǎn)品酶活力：液體 300u/ml，固體 300 u/g 國內(nèi)幾 大生產(chǎn)廠家 廣州裕立寶生物科技有限公司 , 是一家廣州市政府認(rèn)定的高新技術(shù)企業(yè)，從事酶制劑的研發(fā)與生產(chǎn)。 該公司主要生產(chǎn)液態(tài)纖維素酶。 北 京盛世嘉明科技開發(fā)有限公司的前身是北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司銷售公司，北京寧馨兒生物科技開發(fā)有限公司是依托中國科學(xué)院微生物研究所和中國食品發(fā)酵研究所的科研力量專門從事科研成果轉(zhuǎn)化的科研 生產(chǎn)型企業(yè)，主要從事酶的生產(chǎn)和應(yīng)用技術(shù)的開發(fā)與研究。該公司生產(chǎn)食品級纖維素酶，售價為 萬 /噸。 該產(chǎn)品酶活為 10000U/g。 上海三杰生物技術(shù)有限公司主要生產(chǎn)粉狀纖維素酶： 黃褐色冷凍干粉，酶活力 ≥15u/mg ， 15 元 /1 克 ； 黃褐色冷凍干粉，酶活力 ≥300u/mg ， 23 元 /克 。 邢臺市太和生物化學(xué)技術(shù)有限公司主 要生產(chǎn)中性 固態(tài)纖維素酶，酶活為2021U/g， 萬 /噸。 廣州薈科生物科技有限公司 主要生產(chǎn)液態(tài)纖維素酶， 棕色液體 ， pH 值 在 左右（原液） ，售價為 萬 /噸。 此外還有 寧夏和氏璧生物技術(shù)有限公司 ， 上海諾科化工新材料有限公司 ， 東莞寶麗美化工有限公司 ， 湖北立業(yè)生物制品有限公司 ， 廣州伯凱生物技術(shù)有限公司 。 由上面的 一些資料可以看出固態(tài)的酶比液態(tài)的酶要貴。固態(tài)的酶的價格相差也很大，主要看其酶活，酶活越大，價格越高。本設(shè)計生產(chǎn)的酶為固態(tài)的纖維素酶，酶活在 10000U/g.，由上面的價格參考來看可以賣到 10 萬 /噸左右。 本設(shè)計的目的和內(nèi)容 本設(shè)計的目的 纖維素酶幾乎能用于以植物為原料的一切加工業(yè)，在飼料添加劑、紡織業(yè)、石油開采、果蔬加工、發(fā)酵工業(yè)、造紙、中成藥加工等方面有著非常廣泛的用途，特別在飼養(yǎng)、釀酒行業(yè)需求很大，僅水洗布，國內(nèi)每月就需求 5000 噸左右，而且目前國內(nèi)該產(chǎn)品是缺口，每年需大量外匯進(jìn)口。 到目前為止，我國液體纖維素酶生產(chǎn)廠家較少，產(chǎn)量很小。根據(jù)市場調(diào)查和研究分析，纖維素酶的應(yīng)用，不但能夠提高產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量，而且可大大地降低生產(chǎn)成本，該產(chǎn)品的生產(chǎn)彌補(bǔ)了國內(nèi)市場缺口，因此具有較大的發(fā)展?jié)摿蛷V闊的市場前景。預(yù)計在今后的幾年內(nèi)，該產(chǎn)品在國際市場上仍將供不應(yīng)求。 本設(shè)計的主要內(nèi)容 中國礦業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 17 頁 本設(shè)計的主要內(nèi)容有：工廠總平面布置、全廠工藝流程設(shè)計、工藝計算、設(shè)備的計算與選型、成本核算；另外，完成設(shè)計圖紙 8 張，有工廠總平面布置圖、工藝流程圖（ 3 張）、發(fā)酵罐設(shè)計圖、 種子罐設(shè)計圖、發(fā)酵車間設(shè)備布置圖（ 2 張 ） 。 中國礦業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 18 頁 2 全廠工藝流程及論證 工藝論證 無菌空氣制備系統(tǒng)工段工藝論證 無菌空氣系統(tǒng)工藝流程 空氣 粗過濾器 儲 氣 一級冷卻 空氣加熱 絲網(wǎng)分離 二級冷卻 旋風(fēng) 分離 空氣總過濾 空氣分過濾 纖維素酶為好氧發(fā)酵生產(chǎn)，需大量空氣。作為氧源，空氣中含有大量各式微生物，會干擾甚至破壞預(yù)定發(fā)酵的正常進(jìn)行。所以，空氣的除菌成為耗氧發(fā)酵工程的一個重要環(huán)節(jié)?！盁o菌空氣”通常指經(jīng)過除菌過濾后，空氣的含菌量限制在 105內(nèi)。 發(fā)酵工業(yè)工廠所使用的空氣除菌流程隨各地的氣候條件不同而有很大差別。本設(shè)計根據(jù)當(dāng)?shù)氐那闆r，采用“兩級冷卻 、 分離 、 加熱”的空氣除菌流程，它可適應(yīng)各種氣候條件，尤其適用于潮濕的地區(qū)，能充分的分離空氣中含有的水分，提高過濾效率。第一次冷卻后空氣中大部分的水和油 結(jié)成較大的霧粒析出，由旋風(fēng)分離器分離。第二冷卻器使空氣進(jìn)一步冷卻，析出一部分較小的霧粒，由絲網(wǎng)分離器分離。通常第一級冷卻到 30— 35℃，第二級冷卻到 20— 25℃除水后相對濕度仍為 100%，須再用加熱的方法將空氣的相對濕度降至 40%— 50%，再通過空氣過濾器過濾除菌。 1）采風(fēng)： 采風(fēng)口設(shè)在離地面 10m以上，以保證采到較潔凈的空氣，空氣含菌量保 持在103— 104之間。 2）高效前置過濾： 利用壓縮機(jī)的抽吸作用，使空氣經(jīng)高效過濾后，進(jìn)入壓縮空氣機(jī)，無菌程度高。 3）空氣壓縮： 一般工廠選用往復(fù)式空氣壓縮 機(jī)供氣，但它的運(yùn)轉(zhuǎn)使空氣帶進(jìn)油霧，導(dǎo)致傳熱面的油膜影響，降低空氣的給熱系數(shù)，給空氣冷卻帶來困難。雖然離心式空氣壓縮機(jī)和渦輪式空壓機(jī)沒有易損的零部件，沒有潤滑油的污染，但其比較適用于大 中國礦業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 19 頁 型發(fā)酵工廠（投資大），由于本廠是中小型工廠設(shè)計，所以采用水冷式無油潤滑的往復(fù)式壓縮機(jī)。 4）空氣貯罐 ： 作用是消除壓縮機(jī)排出空氣量的脈動，維持穩(wěn)定的空氣壓力，同時也可以利用重力沉降作用分離部分油霧。采用立式貯氣罐。 5）一級冷卻： 經(jīng)過壓縮的空氣溫度很快達(dá)到 120℃。 經(jīng)過一級冷卻，溫度降至 35℃，使大部分的水和油結(jié)成較大的霧粒 析出。 6）油水分離： 一級冷卻后，大部分的水和油結(jié)成較大的霧粒析出，由旋風(fēng)分離器分離。 7）二級冷卻： 空氣進(jìn)一步冷卻至 20℃，使部分水分結(jié)成較小的霧粒。 8）油水分離： 第二次冷卻后，析出一部分較小的霧粒，由絲網(wǎng)分離器分離。經(jīng)第二次冷卻，分離后的空氣，油水去除得較為徹底。 9）加熱： 二次冷卻后，空氣的相對濕度仍為 100%。相對濕度較大，通過過濾器時易打濕過濾介質(zhì)使之失效。加熱空氣至 35℃，可以將相對濕度降低至 40%— 50%，保護(hù)過濾介質(zhì)。 10）過濾除菌： 介質(zhì)借助慣性碰撞，截留，沉降，凝聚等作用除去 微生物和較小的塵埃顆粒。 發(fā)酵工段工藝論證 發(fā)酵工藝流程 里氏木霉 斜面培養(yǎng)基 搖瓶培養(yǎng) 種子罐 稻草 洗凈 粉碎 滅菌處理 發(fā)酵罐 菌種選取 國外對纖維素酶的研究有近 40 多年的歷史，纖維素酶產(chǎn)生菌 主要有木霉、青霉和曲霉等，其中里氏木霉被認(rèn)為是最好的纖維素酶產(chǎn)生菌之一。 里氏木霉能用于纖維素酶生產(chǎn)在于其具備如下條件： 1 里氏木霉生產(chǎn)纖維素酶產(chǎn)量要高。而且可以通過物理或化學(xué)誘變獲取高產(chǎn)菌株； 2 里氏木霉容易培養(yǎng)和控 中國礦業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)設(shè)計 第 20 頁 制。里氏木霉要求的生長環(huán)境粗放，適應(yīng)性較強(qiáng)，易于控制，便于管理； 3 里氏木霉產(chǎn)纖維素酶的穩(wěn)定性好。在通常的生產(chǎn)條件下，能夠穩(wěn)定的用于生產(chǎn)，不宜退化； 4 里氏木霉產(chǎn)生的纖維素酶容易分離純化。其產(chǎn)生的纖維素酶是胞外酶，發(fā)酵完成后，纖維素酶容易與菌體分離純化得到所需的酶； 5 里氏木霉及其代謝物安全無毒，不會影 響生產(chǎn)人員和環(huán)境，也不會對纖維素酶的生產(chǎn)造成不良影響。 綜上，在本設(shè)計中我選擇里氏木霉作為生產(chǎn)菌種。 培養(yǎng)基 斜面培養(yǎng)基 土豆 PDA 斜面 , 30 ℃培養(yǎng) 6 d 后使用。