【正文】 三鐵和氧化釓表面都含有羧基（ CO），通過胱胺表面的兩個氨基可以把四氧化三鐵和氧化釓連在胱胺的兩邊。中間通過雙硫鍵連接，由于雙硫鍵的特殊結構，其可以被在腫瘤組織中高表達的谷胱甘肽及強還原物質打開，在體內只能被谷胱甘肽打開，所以可以用于人體用于對腫瘤的特異性診斷。當雙硫鍵沒有被打開時，由于四氧化三鐵產生的強磁場對氧化釓的淬滅作用， MRI T1為黑色或灰色，但當雙硫鍵被 GSH 打開時， T1 信號 變明亮，則提示腫瘤組織的存在。其作用原理如下圖 。 圖 可激活 MRI 納米探針 作用原理圖 實驗試劑及器材 （ 1）所用材料： 試劑：半胱胺酸（北京百靈威科技有限公司）； 氫氧化鈉（滬試，國藥集團化學試劑有限公司）； 二氯甲烷（滬試，國藥集團化學試劑有限公司）。 材料： EP 管 、移液器槍頭、一次性吸管（ 美國 AXYGEN 公司 ） （ 2）所用器材： 徐州醫(yī)學院 2021 屆本科生畢業(yè)設計（論文） 第 14 頁 超純水儀（美國， MilliQ Refereme）； 智能恒溫定時磁力攪拌器，型號： B123（上海司樂儀器有限公司）； 10μ L、 20 mL、 100 mL、 1000 mL 微量移液器，（ 德國 Eppendorf 公司 ）； 旋轉蒸發(fā)器，型號： RE52AA，（上海亞榮生化儀器廠）； SHZD（ III）循環(huán)水式真空泵，（鞏義市予華儀器有限責任公司）； 舒美超聲波清洗器，型號： KQ218（昆山市超聲儀器有限公司）； 電子天平，（上海精密科學儀器有限公司）； 電熱恒溫干燥箱 ，（ 上海躍進醫(yī)療器械廠 ）； 4℃冰箱，（中國海爾集團）。 實驗步 驟 （ 1）稱取 半胱胺酸和 氫氧化鈉，溶于 300mL 蒸餾水，超聲使之混合均勻； （ 2）常溫下磁力攪拌 30 分鐘得到透明液體； （ 3）按照 1:1 的比例?。?2）中制好的液體和二氯甲烷在分液漏斗中進行粹?。ɑ靹?、放氣連續(xù)三次），粹取完的液體分成兩層（一層水相，一層油相），收集下面的二氯甲烷在 30℃的條件下旋轉蒸發(fā)； （ 4）重復（ 3）直到所有（ 2）制好的液體粹取蒸發(fā)完，得到淡黃色透明液體，即胱胺。 本實驗利用化學沉淀法制備 Fe3O4納米粒子，并通過透射電鏡、 MRI 響應、傅里葉紅外光譜分析對制 備的 Fe3O4納米粒子的特性進行表征；通過 MRI 響應、傅里葉紅外光譜分析對制備的 PEGGd2O3納米粒子的特性進行表征；通過傅里葉紅外光譜分析對制備的胱胺進行表征。實驗數據表明 Fe3O4 納米粒子、 PEGGd2O3納米粒子以及“連接物”胱胺制備成功，可以用于后續(xù)實驗。 徐州醫(yī)學院 2021 屆本科生畢業(yè)設計（論文） 第 15 頁 3 可激活 MRI 納米探針 Fe3O4SSGd2O3 的制備 為了確定可激活對比劑中四氧化三鐵（ Fe3O4 ）納米粒子和氧化釓（ PEGGd2O3）的最佳濃度，需要四氧化三鐵和氧化釓的濃度進行優(yōu)化處理。用控制單一變量的方法，首先確 定一個氧化釓的量，通過改變四氧化三鐵的濃度，配制溶液進行 MRI 掃描，得到四氧化三鐵的最佳濃度；然后再同理按照上述方法，確定最佳氧化釓和谷胱甘肽的濃度。 Fe3O4SSGd2O3的傅里葉變換紅外光譜分析 為了驗證 Fe3O4 表面及 PEGGd2O3 表面的羧基與胱胺上的氨基共價結合成Fe3O4SSGd2O3 納 米 探 針 ， 我 們 將 稀 釋 的 Fe3O4COOH 、 PEGGd2O3 、Gd2O3cystamine 和 Gd2O3SS Fe3O4納米探針進行傅里葉變換紅外光譜分析。紅外光譜分析的結果用 Origin 作圖，可得下圖 。 圖 納米探針組裝的紅外光譜圖 圖 中顯示 PEGGd2O3與胱胺反應后，出現游離的氨基，在 33003500cm1之間出現雙峰，同時羧基中的 C=O 向低頻移動，為酰氨鍵中的 C=O，與Fe3O4COOH 進一步結合后，游離的 NH2消失，說明與 Fe3O4上的羧基發(fā)生縮合反應。 說明 Fe3O4SSGd2O3納米探針共價組裝的成功制備。 不同濃度四氧化三鐵（ Fe3O4）納米粒子對 MRI 信號的影響 首先準備 PEGGd2O3SSNH2：取一定量的 PEGGd2O3和 乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽 （ EDC），在 37℃ 電熱恒溫水槽 (DK8D)中孵育 15min，之后加入與 EDC 等量的 N羥基琥珀酰亞胺 （ NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育 2 小時。 4000 3000 2021 1000 0Fe3O4 C OO HGd2O3 S S Fe3O4P E GGd2O3Gd2O3 c y s t a mi neTransmittanceWa v enumb er ( cm1)3430 OHC = O1750C = O1640 N H2徐州醫(yī)學院 2021 屆本科生畢業(yè)設計（論文） 第 16 頁 取 5 個 的 EP 管，編號為 1—5，在其中都加入 500μL 的PEGGd2O3SSNH2；然后再分別在 5 個 EP 管中加入 （其中含 ）、 100μL（其中含 Fe3O4 ）、 150μL（其中含 Fe3O4 ）、 200μL（其中含 Fe3O4 ）、 250μL（其中含 Fe3O4 ）；在用移液器分別在 5 個 EP 管中加入蒸餾水 、 、 110μL、 、 ，配成總量一定的 5 個溶液。用高速冷凍離心機在 10000 轉每分的條件離心 10min，倒掉上清液，并分別分散于 500μL 蒸餾水中，最終制成 5 個 Fe3O4 濃度不同的Fe3O4SSGd2O3溶液。 為了便于對比分析，每個樣品分別配 2 管掃 MRI，其中一管加 250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和 10μL蒸餾水，另一管加 250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（ 10mM GSH）。制成共 10 個樣品掃 MRI。結果如圖 。 圖 不同濃度 Fe3O4下 GSH 的 MRI 信號響應 從圖 可以看出，當有谷胱甘肽存在時，磁共振信號比沒有谷胱甘肽時的磁共振信號亮度明顯增強，當 Fe3O4納米粒子的 含量為 時，圖像的信噪比最大。所以，最終選擇的 Fe3O4最佳濃度為 ， 也即四氧化三鐵質量為 時，圖像信噪比最大，圖像質量最高。 不同濃度氧化釓（ PEGGd2O3）對 MRI信號的影響 首先也是準備 PEGGd2O3SSNH2：取一定量的 PEGGd2O3和 乙基二甲基氨基丙基碳化二亞胺鹽酸鹽 （ EDC），在 37℃ 電熱恒溫水槽 (DK8D)中孵育 15min，之后加入與 EDC 等量的 N羥基琥珀酰亞胺 （ NHS）和少許胱胺，繼續(xù)孵育 2 小時。由于本實驗中 Fe3O4的量固定不變，所以 EDC 和 NHS 的量都不需改變。 由 可知，四氧化三鐵的最佳濃度為： ，所以在討論氧化釓的最佳徐州醫(yī)學院 2021 屆本科生畢業(yè)設計（論文） 第 17 頁 濃度時，四氧化三鐵的濃度取最佳濃度。又由于在 中對四氧化三鐵濃度優(yōu)化時，選擇氧化釓量為 500μL，因此本實驗中設置的氧化釓的濃度改變時必須包括500μL。 然后取 7 個 的 EP 管，編號為 1—7，在其中都加入 150μL的 的 Fe3O4；然后分別在 7個 EP管中加入制備好的 PEGGd2O3SSNH2100μL、 200μL、300μL、 400μL、 500μL、 600μL、 800μL；再用移液器分別在 5 個 EP 管中加入蒸餾水 700μL、 600μL、 500μL、 400μL、 300μL、 200μL、 0μL，配成總量一定的 7個溶液。用高速冷凍離心機在 10000 轉每 分的條件離心 10min，倒掉上清液，并分別分散于 500μL 蒸餾水中，最終制成 7 個 PEGGd2O3 濃度不同的Fe3O4SSGd2O3溶液。 為了便于對比分析，每個樣品分別配 2 管掃 MRI，其中一管加 250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和 10μL蒸餾水，另一管加 250μL Fe3O4SSGd2O3溶液和與蒸餾水等量的谷胱甘肽（ 10mM GSH）。制成共 14 個樣品掃 MRI。結果如圖 。 圖 不同濃度 PEGGd2O3下 GSH 的 MRI 信號響應 從圖 可以看出，當有 谷胱甘肽存在時，磁共振信號比沒有谷胱甘肽時的磁共振信號明顯變明亮許多，當 PEGGd2O3為 500μL時，圖像信噪比最大。所以認為 PEGGd2O3的最佳濃度為 500μL，當 PEGGd2O3濃度為 500μL時，圖像信噪比最大，圖像質量最高。 谷胱甘肽（ GSH）對 T1弛豫率 的影響 按照 和 描述的方法制備 Fe3O4SSGd2O310mL，準備 14 個 的EP 管，分別編號為 a1a7（沒有谷胱甘肽）、 p1p7（有谷胱甘肽），在 a1a7 中分別加入 250μL Fe3O4SSGd2O 10μL蒸餾水， 200μL Fe3O4SSGd2O 60μL蒸餾徐州醫(yī)學院 2021 屆本科生畢業(yè)設計（論文） 第 18 頁 水， 150μL Fe3O4SSGd2O 110μL蒸餾水， 100μL Fe3O4SSGd2O 160μL蒸餾水， 50μL Fe3O4SSGd2O 210μL蒸餾水， 25μL Fe3O4SSGd2O 235μL蒸餾水，260 蒸餾水。 p1p7 中 Fe3O4SSGd2O3分別與 a1a7 相同，并加入與 a1a7 中與蒸餾水等量的 的 GSH。 磁共振掃描 T1 弛豫率的回歸方程如圖 。 圖 GSH 對不同濃度 PEGGd2O3的 MR 信號 T1弛豫率影響 從圖 曲線可以看出，當有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的 MR 信號T1弛豫時間的回歸方程為： y=+，即有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的 MR 信號 T1弛豫率為 。然而，當沒有谷胱甘肽時，不同濃度氧化釓的 MR 信號 T1弛豫時間的回歸方程為： y=+，即沒有谷胱甘肽存在時，不同濃度氧化釓的 MR 信號 T1弛豫率為 。也就是說，有谷胱甘肽存在時的弛豫率是沒有谷胱甘肽時的近 3 倍， 說明所制備的納米探針對谷胱甘肽有靈敏的 MR 響應，有望用于腫瘤細胞內 GSH 的 MRI。 不同濃度谷胱甘肽（ GSH） 的 MRI 信號 響應 同理制備 Fe3O4SSGd2O33mL，準備 12 個 的 EP 管，編號為 112，在12 個 EP 管中都加入 150μL Fe3O4SSGd2O3， 112 號 EP 管中分別加入 110μL蒸餾水 ,109μL 蒸餾水、 GSH、 蒸餾水， 1μL GSH， GSH、 108μL蒸餾水， GSH、 107μL蒸餾水， GSH、106μL蒸餾水， GSH、 105μL蒸餾水， GSH、 104μL蒸餾水， GSH、 103μL蒸餾水， GSH、 102μL蒸餾水， GSH、 101μL蒸餾水， GSH、 100μL蒸餾水制成總量為 260μL的 12個樣品。 磁共振掃描的 T1弛豫率的回歸方程 如圖 。 徐州醫(yī)學院 2021 屆本科生畢業(yè)設計（論文） 第 19 頁 圖 不同濃 度 GSH 的 MRI T1弛豫率 由于腫瘤組織中 GSH 含量遠遠高于正常組織，從圖 可以看出，當 GSH濃度大于等于 4mmol/L 時， T1弛豫時間改變明顯， 文獻記載腫瘤組織的 GSH 含量大于 5mmol，而正常組織中 GSH 的含量約為 。因此可激活納米探針 可以把腫瘤組織和正常組織區(qū)分開。達到特異性診斷腫瘤的目的。 討論 本章節(jié)首先通過控制單一變量的方法對制備的可激活磁共振對比劑Fe3O4SSGd2O3 納米探針 的濃度進行優(yōu)化，從而最終確定 Fe3O4 最佳濃度為， PEGGd2O3的最佳濃度為 500μL；然后通過比較有無谷胱甘肽存在時材料的 MRI 掃描 T1弛豫率，數據表明當有谷胱甘肽存在時， T1弛豫率明顯提高，對比效果更佳，且當 GSH 濃度超過 3mol/L 時，弛豫率明顯改變，而腫瘤組織中 GSH 高表達，從而可以實現對腫瘤組織的特異性診斷；最后通過傅里葉紅外光譜分析對材料進行表征并比較，證明 可激活磁共振對比劑 Fe3O4SSGd2O3納米 探針制備成功。