【正文】 增測序模板，可直接對單個 DNA 分子進(jìn)行序列測定。 HeliScope 測序技術(shù)的測序通量可以達(dá)到 35 Gb，平均測序讀長為 35nt（ nucleotide 核苷酸），在測序深度為 20 倍覆蓋率的情況下，測序準(zhǔn)確率為 %。并且由于無需 PCR 擴(kuò)增待測模板，避免了 PCR 非特異性擴(kuò)增 的影響，簡化了文庫制備過程。目前 HeliScope 測序技術(shù)已有所應(yīng)用，但是由于單分子測序設(shè)備價格十分昂貴，使其推廣應(yīng)用存在一定困難。 和 HeliScope 一樣， SMRT 測序技術(shù)也是單分子測序技術(shù)的一種 。 SMRT 測序技術(shù)的單分子熒光檢測設(shè)備采用零模式波導(dǎo)技術(shù)，可以將激發(fā)光局限在反應(yīng)孔底部很薄的空間內(nèi)，價格低于全內(nèi)反射顯微鏡，使測序成本比 HeliScope 測序技術(shù)有所降低。 SMRT 測序技術(shù)的測序速度可以達(dá)到 每 秒，且測序讀長可以達(dá)到 3000 nt，比 HeliScope 測序技術(shù)有明顯提高。但是， SMRT 測序技術(shù)目前仍處于試用階段。 Oxford 納米孔測序技術(shù)也是一種單分子測序技術(shù)。它利用鑲嵌于脂質(zhì)雙分子層中的經(jīng)過基因工程改造過的 α 溶血素蛋白作為納米孔道。Oxford 納米孔測序 技術(shù)的測序速度可以達(dá)到 20400 nt/s，將來有可能實(shí)現(xiàn) 15 分鐘完成人類基因組測序。然而納米孔測序的準(zhǔn)確度依然不盡如人意，目前其測序錯誤率在 4%左右。 不同于第二代測序依賴于 DNA 模板 PCR 擴(kuò)增，使 DNA 模板與固體表面相結(jié)合然后邊合成邊測序的方法，第三代測序?yàn)閱畏肿訙y序，不需要進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增。第三代測序方法與現(xiàn)在的測序技術(shù)相比之下的優(yōu)點(diǎn)為 （ 1）更高的通量；（ 2）更短的測序時間； （ 3）更長的讀取長度； （ 4）更高的精確性，可以檢測出極少的變異； （ 5）需要很少的起始量； （ 6）低成本。 下面簡要的介紹一下新一代測序技術(shù)的特點(diǎn)和應(yīng)用： 1． 新一代測序技術(shù)的特點(diǎn) 回顧三代測序技術(shù)的整過進(jìn)程，最直觀的一點(diǎn)是測序技術(shù)由固態(tài)技術(shù)與生物化學(xué)技術(shù)相結(jié)合，然后是從生物化學(xué)或化學(xué)手段向物理手段發(fā)展，接下來新一代測序技術(shù)將以納米技術(shù)和單分子測序技術(shù)為主。新一代測序技術(shù)將憑借低成本、高通量、長讀長等各大顯著特點(diǎn)引領(lǐng)測序技術(shù)走向嶄新的時代。 2． 新一 代測序技術(shù)的應(yīng)用 新一代測序技術(shù)的優(yōu)勢毋庸置疑，然而不同 時 代測序技術(shù)并不互相排斥，新一代技術(shù)出現(xiàn)并不意味著原有的平臺完全過時。由于不同 時 代技術(shù)之間功能上的互補(bǔ)性 , 它們將長期 共存。典型的例子是第二代測序平臺的測序通量遠(yuǎn)高于基于Sanger 法的第一代測序平臺 , 但依然沒有完全取代第一代測序技術(shù)。具有讀長優(yōu)勢以及原始數(shù)據(jù)準(zhǔn)確的 Sanger 法將用于小規(guī)模測序的縫隙市場，而第二代和第三代測序儀將用于大規(guī)模的項(xiàng)目。 單分子測序技術(shù)代表了基因測序技術(shù)的未來，但目前這項(xiàng)技術(shù)的最大障礙是失誤率較高。現(xiàn)有的測序儀器的準(zhǔn)確率能達(dá)到 99% 天津工業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 9 以上，但是根據(jù)太平洋生物科技公司 2021 年 10 月份的報告 [42]中顯示其 測序儀器的準(zhǔn)確率約為 85%。 也有人 認(rèn)為，這一缺點(diǎn)能通過重復(fù)測序來克服。 隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，完全可以實(shí)現(xiàn)將測定一個人的基因組的全部成本控制在 500 元到 5000 元 之內(nèi)。真的成本有這么低嗎？目前幾乎所有的測序和分析的數(shù)據(jù)成本基本上都是耗材和試劑的成本。測序儀器產(chǎn)生數(shù)據(jù)。然后進(jìn)行從頭拼接、組裝、重測序、基因注釋等等，這些是極度耗費(fèi)人力和財(cái)力的。相信將來大規(guī)模測序工作將轉(zhuǎn)移到大型的商業(yè)化的公司和服務(wù)商，而不是在小型的實(shí)驗(yàn)室和小型的研究中心中進(jìn)行，倘若現(xiàn)在的預(yù)期能變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)， 500 元測定個人基因組的愿望還是可以實(shí) 現(xiàn)的。如此廉價的測序成本、如此快速的測序設(shè)備將引領(lǐng)我們開辟新的基因組學(xué)分析、疾病診斷以及個性化（個體化）醫(yī)療等新領(lǐng)域 。 基因組拼接技術(shù)簡介 基因組拼接技術(shù)的研究現(xiàn)狀 對于一種細(xì)菌，只包含單一的染色體，一個基因組工程就是致力于映射染色體中的序列。對于人類，包含 22 對常染色體和 2 條性染色體，完整的基因序列就是包含 46 條染色體中的所有的基因序列。經(jīng)過基因測序就可以得到每條染色體中的基因序列，這樣的序列并非是完整的，而是一些短小的、重復(fù)的、無序的、包含錯誤的序列片段（術(shù)語稱“ reads”，讀長）。 基因組計(jì)劃的目 標(biāo)是獲得所研究的生物的全基因組序列，而序列拼接是基因組測序階段生物信息學(xué)研究的最基本、最重要的問題。眾所周知，生物的基因組是指該生物所有遺傳物質(zhì)的總和，絕大部分基因組由 DNA(脫氧核糖核酸 )組成。DNA 是由核苷酸單體構(gòu)成的線性、無分支的多聚分子。核苷酸由堿基區(qū)分， DNA中，堿基分別是腺嘌呤 (Adenine)、胞嘧啶 (Cytosine)、鳥嘌呤 (Guanine)和胸腺嘧啶 (Thymine)，分別用字母 A， C， G， T 表示?；蚪M測序就是要確定 DNA 分子的堿基序列。對于完整基因組自上而下的測序過程一般包括三個步驟 ：（ 1）建立克隆的物理圖譜，如酵母人工染色體 YAC（ Yeast Artificial Chromosome）克隆、細(xì)菌人工染色體 BAC（ Bacterial Artificial Chromosome）克隆等；（ 2）利用鳥槍法（ Shotgun Strategy）測定每個克隆的序列；（ 3）注釋。當(dāng)?shù)玫揭欢?DNA 序列之后，可以利用序列分析工具，通過與數(shù)據(jù)庫序列的比較，得到與該序列相關(guān)的信息，如基因、調(diào)控元件、重復(fù)區(qū)域等，進(jìn)而對序列的生物學(xué)特性進(jìn)行注釋。人類基因組計(jì)劃（ HGP）采用的就是這種策略。 Venter 提 出的戰(zhàn)略構(gòu)想正好與目前的人類基因組計(jì)劃相反，即首先是測序，然后才是在測序的基礎(chǔ)上作圖。 Venter 把這種戰(zhàn)略 稱為 “ 全基因組隨機(jī)測序 ” 也 稱為 “ 全基因組鳥槍戰(zhàn)略 ” (whole genome shotgun strategy)。 在大規(guī)模 DNA 測序中，目標(biāo) DNA 分子的長度可達(dá)上百萬個 bp?，F(xiàn)在還不能直接測定整個分子的序列，然而，可以得到待測序列的一系列序列片段。序列 天津工業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 10 片段是 DNA 雙螺旋中的一條鏈的子序列（或子串）。這些序列片段覆蓋待測序列，并且序列片段之間也存在著相互覆蓋或者重疊。在一般情況下，對于一個特定的 片段，我們不知道它是屬于正向鏈還是屬于反向鏈，也不知道該片段相對于起點(diǎn)的位置。 另外，這樣的序列片段中還可能隱含錯誤的信息。序列片段的長度范圍300—1000bp，而目標(biāo)序列的長度范圍是 30000—1000000 bp，總的片段數(shù)目可達(dá)上千個。 DNA 序列片段拼接（ DNA sequence assembly ，又稱序列拼接）的任務(wù)就是根據(jù)基因組測序得到的上千萬個小片段序列通過比對再正確拼接起來。如果能夠得到 DNA 一條鏈的序列，那么根據(jù)互補(bǔ)原則，另一條鏈的序列也就得到了。當(dāng)前世界范圍內(nèi)的主要測序中心以及重要的測 序工程都普遍采用了鳥槍(Shotgun)測序法。它根據(jù)目前可以用測序儀直接測出序列的長度水平 ,將較長的DNA 序列的多條克隆隨機(jī)打斷成很短的片斷 ,再通過測序儀精確地將這些小的片斷序列一一測出 ,最后根據(jù)這些小片斷序列間的重疊關(guān)系用計(jì)算機(jī)將它們進(jìn)行拼接 ,以期得到目標(biāo)序列的一個或多個較長的連續(xù)段。 目前用于各種大型測序工程中的拼接軟件很多，最廣泛使用的是美國Washington 大學(xué)的 Phil Green 實(shí)驗(yàn)室開發(fā)的 PhredPhrapConsed 軟件 (Ewing etal.,1998。 Ewing and Green, 1998。 gordon et al.,1998)。該軟件覆蓋了基因組測序的全過程，為基因組測序提供完整的計(jì)算機(jī)解決方案。在它的協(xié)助下，包括 HGP等幾十個規(guī)模不同的測序工程都完成了最后的片段拼接。這套軟件不僅適用于大規(guī)模測序，也適用于一般實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用。 Phil Green 小組一直在不斷地完善和改進(jìn)該套系統(tǒng)。 美國基因組研究所 (The Institute of Genome Research)于 1995 年前后研制了TIGR 拼接軟件 TIGR ASSEMBLER TIGR EDITOR，他們試圖通 過簡化拼接過程中的序列比對 ( sequence alignment)來節(jié)約時間，取得了一定的效果。 2021 年 7 月， 美國南加州 大學(xué)的 Pavel A. Pevzner 等將序列拼接問題轉(zhuǎn)化 成了 一個 基于圖論的尋找 Euler 路徑的問題， 并 在此基礎(chǔ)上 開發(fā)出 了名為 EULER的拼接 算法軟件包 。 此外，還有很多其他比較有特點(diǎn)的拼接軟件，如 GAP、 CAP3/ SeqmanII、SLIC 等，某些在實(shí)際的測序工程中也得到了應(yīng)用，但范圍都不是很廣泛。 國內(nèi)在片段拼接方面的研究主要開始于近幾年，目前主要集中在北京大學(xué)和中科院北京華 人基因研究中心，后者承擔(dān)和完成了 HGP 國際大合作中 1%的測序工作并在國際上首次獨(dú)立進(jìn)行在中國廣泛種植的水稻 ( Oryza sative L. ssp. Indica)全基因組的測序拼接工作，并取得成功。 近年來，為了進(jìn)一步提高拼接速度，人們開始研究序列拼接的并行處理，這方面國外較著名的是 SPSOFT(Southwest ParalleSoftware)(它實(shí)現(xiàn)了 Phrap 程序的 SMP 機(jī)并行版本，主要是利用多線程技術(shù)加速其中具有 天津工業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 11 并行性的部分，獲得較好的效率，最近， 它完成了 Linux 環(huán)境下的并行 Phrap。在國內(nèi)，中科院計(jì)算技術(shù)研究所與華大基因研究中心合作，基于曙光 3000 超級計(jì)算機(jī)系統(tǒng)，開發(fā)了 Phrap 的并行算法，實(shí)現(xiàn)了 Phrap 的并行化。 總之， 當(dāng)前基因 序列拼接問題的研究可以歸為三點(diǎn) ： 第一，序列拼接問題的研究集中在提高拼接速度和準(zhǔn)確度上。第二，就提高序列拼接速度問題而言，單機(jī)上的拼接算法研究已經(jīng)相當(dāng)廣泛深刻，機(jī)群系統(tǒng)上的拼接算法研究剛剛開始。第三，測序所得原始數(shù)據(jù)的出現(xiàn)是隨機(jī)的且總體上的相關(guān)性比較大，而現(xiàn)有拼接算法的計(jì)算局部性較差，并行難度大，并且研究下處于起步階 段。 圖 15 基因測序過程示意圖 基因組重測序技術(shù) 基因組重測序顧名思義是對于已經(jīng)測序完成的序列，由于某種 需求 （如設(shè)計(jì)標(biāo)記、 SNP 挖掘 、尋找結(jié)構(gòu)變異位點(diǎn) 等）要對此物種中的不同 個體進(jìn)行 再次測序。因?yàn)橛辛藚⒖蓟蚪M，所以一般只要用第二代測序方法大規(guī)模測序，然后對照參考基因組 進(jìn)行 拼接即可。全基因組重測序是對已知基因組序列 （參考基因）的物種進(jìn)行不同個體的基因組測序，并 分析 個體或群體 的 差異性 ，從而發(fā)現(xiàn)生物的遺傳特性 。 SBC 將不同梯度插入片段（ InsertSize）的測序文庫結(jié)合短序列（ ShortReads）、雙末端 （ PairedEnd）進(jìn)行測序，幫助客戶在全基因組水平上掃描并檢測與重要性狀相關(guān)的基因序列差異和結(jié)構(gòu)變異，實(shí)現(xiàn)遺傳進(jìn)化分析及重要 天津工業(yè)大學(xué) 2021 屆本科生畢業(yè)論文 12 性狀候選基因預(yù)測 。 基因組無模版拼接技術(shù) 基因組 無模版拼接技術(shù)，又叫 基因組 從頭 拼接 即 de novo 測序， 指 不需要任何參考序列資料即可對某個物種 的基因 進(jìn)行測序，用生物信息學(xué)分析方法進(jìn)行拼接、組裝，從而獲得該物種的基因組序列圖譜。利用全基因組從頭測序技術(shù)，可以獲得動物、植物、細(xì)菌、真菌的全基因組序列，從而推進(jìn)該物種的研究。一個物種基因組序列圖譜的完成，意味著這個物種學(xué)科和產(chǎn)業(yè)的新開 端！這也將帶動這個物種下游一系列研究的開展。全基因組序列圖譜完成后，可以構(gòu)建該物種的基因組數(shù)據(jù)庫，為該物種的后基因組學(xué)研究搭建一個高效的平臺；為后續(xù)的基因挖掘、功能驗(yàn)證提供 DNA 序列信息。 新一代基因測序技術(shù)所產(chǎn)生的序列片段具有序列短、高覆蓋度、額外的雙端信息等特點(diǎn) ,這使得原有的一些傳統(tǒng)的拼接技術(shù)無法使用 ,加大了拼接問題的復(fù)雜度和難點(diǎn)。面對如此海量的數(shù)據(jù) ,高效的序列拼接技術(shù)成為處理測序數(shù)據(jù)的關(guān)鍵。 基于 de Bruijn 圖的拼接 方法 簡要步驟 如下： 1． 先將基因組按照一定的覆蓋度生成多個副本，然后將所有的副本基因 包括原始基因組進(jìn)行 隨機(jī) 打散， 利用相關(guān)的方法 進(jìn)行雙端測序， 最終 得到 該生物的基因組序列 數(shù)據(jù)（ read pair） ， 數(shù)據(jù)文件（ fastq 格式 ） 中包含每個堿基的質(zhì)量系數(shù) 。 2． 利用 fastq 格式的基因序列文件中每個堿基的質(zhì)量系數(shù)，對基因序列進(jìn)行糾錯。 3． 將糾錯之后的 read pair 讀入到內(nèi)存中， 設(shè)定 kmer，構(gòu)建 de Bruijn 圖數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)來表示 read 間的 重復(fù)區(qū)域（ overlap） 。 4． 通過移除 圖中錯誤的連接和一些小的分支 ，解決微小的重復(fù)來簡化 de Bruijn 圖。 5． 在簡化圖的基礎(chǔ)上，利用找到一條最優(yōu)路徑， 根據(jù)最優(yōu)路 徑 輸出 最終的拼接 序列 (contigs)。 6． 再次使用讀長對 和 contig 進(jìn)行比對，使用 讀長對的 信息來把 所有的contig 進(jìn)行排序 并 連接成 scaffolds。 7． 最后，使用 讀長對 來填補(bǔ) 多個 contig之間的空缺 (Gap)， 從而 得到比 contig更長的 scaffolds。