細胞生物學實驗ppt課件-資料下載頁
2025-05-12 01:19本頁面
【正文】 盡量使兩種溶液明顯分層。以 1500g(4752rpm)離心 15～ 20min。棄上清液，沉淀即為經(jīng)過純化的細胞核，用 PBS溶液懸浮， 4?C保存。 ? 細胞經(jīng)甲基綠 派洛寧混合液處理后，其中的DNA和 RNA出現(xiàn)不同的呈色反應，一般認為這是由于帶有負電荷的核酸對堿性染料派洛寧和甲基綠具有親和力，且這兩種染料的作用有選擇性，甲基綠染高聚分子的 DNA呈藍綠色，派洛寧染低聚分子的 RNA呈紅色。 下次實驗內(nèi)容： （ 4）鑒定：將分離純化的細胞核制成涂片，空氣干燥。將干燥的涂片浸入 95％乙醇溶液固定5min，晾干，滴加甲基綠 派洛寧染液染色 20～30min，丙酮分色 30s，蒸餾水漂洗，濾紙吸干水，鏡檢。 核 DNA呈藍綠色，核仁和混雜的細胞質(zhì) RNA呈紅色。 六、實驗報告 ? 1. 線粒體提取分離過程中，為什么要在 0～ 4℃ 進行？ ? 2. 要獲得高活性的線粒體，在線粒體提取、分離和活性鑒定的過程中需注意哪些問題？根據(jù)你的實際體會，寫出操作注意事項及改進方法。 ? 3. 分離介質(zhì) 液哪一種在下層 ? 有什么作用 ? ? (1)分離 :將分離細胞核時收集的上清液以10000g(12270rpm)離心 10min。沉淀用預冷 蔗糖溶液懸浮 ,10000g離心 10min,反復 2次。 ? (2)鑒定 :在干凈的載玻片中央滴加 1～ 2滴中性紅 詹納斯綠染液 ,用牙簽挑取沉淀物均勻涂片 。 蓋上蓋片 ,染色 5min,鏡檢 。 線粒體藍綠色，呈小棒狀或圓形。 五、實驗結(jié)果 ? 核 DNA呈藍綠色，核仁和混雜的細胞質(zhì)RNA呈紅色。 ? 線粒體藍綠色，呈小棒狀或圓形。 ? 觀察每個視野中所見完整細胞核和線粒體的數(shù)量及純度。 差速離心 （ differential centrifugation） ? 主要是采取逐漸提高離心速度的方法分離不同大小的細胞器。起始的離心速度較低，讓較大的顆粒沉降到管底，小的顆粒仍然懸浮在上清液中。收集沉淀，改用較高的離心速度離心懸浮液，將較小的顆粒沉降，以此類推，達到分離不同大小顆粒的目的。 沉淀 轉(zhuǎn)速 x時間 內(nèi) 容 物 A 150g x 20min 完整細胞 B 1000g x 20min 細胞核 ， 細胞碎片 C 3000g x 6min 葉綠體 D 10000g x20min 線粒體 、 溶酶體 、 微體 E 105000g x120min 微粒體 F 105000g x 20min %脫氧膽酸納 核糖體 密度梯度離心 （ density gradient centrifugation） ? 用一定的介質(zhì)在離心管內(nèi)形成一連續(xù)或不連續(xù)的密度梯度，將細胞混懸液或勻漿置于介質(zhì)的頂部，通過重力或離心力場的作用使細胞分層、分離。 ? 如果分離的顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時，質(zhì)量和密度大的顆粒比質(zhì)量和密度小的顆粒沉降得快，并且每種大小的顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時，即停止不前，最后各種不同大小的顆粒在離心管中被分成獨立的區(qū)帶。 ? 細胞器分離過程中的懸浮介質(zhì)常使用水溶性的蔗糖溶液，因為它比較接近細胞質(zhì)的分散相，在一定程度上，能保持細胞器的結(jié)構(gòu)和功能，保持酶的活性，避免細胞器的聚集。 實驗七 細胞骨架的觀察 考馬斯亮蘭 R250染植物細胞的微絲 一、實驗目的 ? 掌握觀察植物細胞內(nèi)微絲的方法。 ? 了解觀察動物細胞內(nèi)微絲的方法。 二、實驗原理 ? 細胞骨架是指細胞質(zhì)中縱橫交錯的纖維網(wǎng)格結(jié)構(gòu)，按組成成分和形態(tài)結(jié)構(gòu)的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質(zhì)運輸?shù)绕鹬匾饔谩? ? 光學顯微鏡下細胞骨架的形態(tài)學觀察多用 1％Triton X100處理細胞，可使細胞膜溶解，而細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質(zhì)被保存，再用考馬斯亮蘭 R250染色，使得細胞質(zhì)中細胞骨架得以清晰可見。 細胞骨架 微管 微絲 中等纖維 三、材料和試劑 ? 材料：新鮮洋蔥鱗莖 ? 器材：光學顯微鏡、天平、吸管、載玻片、蓋玻片、燒杯、鑷子、剪刀、表面皿、染色缸 ? 試劑： （ ） , 1％ Triton X100（用 M緩沖液配制）， M緩沖液， 3%戊二醛（用 ）， 磷酸緩沖鹽溶液（ PBS， ）， ％考馬斯亮蘭 R250 （ A） Triton X100 (聚乙二醇辛基苯基醚 )作用： 一種非離子去垢劑，適當濃度的 Triton X100，破壞膜結(jié)構(gòu)、 可使細胞膜溶解，而細胞質(zhì)中的細胞骨架系統(tǒng)可被保存。 （ B） M－緩沖液 : M緩沖液使細胞骨架中的微絲保持穩(wěn)定，在 M緩沖液中，其中咪唑是緩沖劑， EDTA （乙二胺四乙酸） 和 EGTA （乙二醇雙醚四乙酸） 螯合 Ca2＋， 并提供 Mg2＋ 離子，在低鈣條件下，骨架纖維保持聚合狀態(tài)并且較為舒張，便于觀察。 （ C）磷酸緩沖液作用： 清洗組織細胞、穩(wěn)定骨架蛋白，維持細胞的滲透壓； （ D）戊二醛作用： 良好的固定劑，使細胞結(jié)構(gòu)保持它原有狀態(tài)； （ E）考馬斯亮蘭作用： 非專一性結(jié)合蛋白質(zhì)，使蛋白著色（藍色）。 ? 實驗的關(guān)鍵： Triton X100 抽提處理的時間很關(guān)鍵，如果處理時間太短，沒有抽提掉細胞器膜上的蛋白，會造成很深的背景顏色，干擾細胞骨架的觀察；如果處理時間太長，會破壞骨架蛋白使骨架纖維斷裂。 四、實驗方法與步驟 ? 1. 取洋蔥近中軸鱗片內(nèi)表皮和靠近外層的鱗莖內(nèi) 表皮作對照，大小 1㎝ 2，放入盛有 緩沖液 [PBS]（ ）的青霉素瓶中； ? 2. 吸去緩沖液，加入 1％ Triton X100處理洋蔥內(nèi)表皮 2030 min； ? 3. 吸去 Triton X100，用 M緩沖液 充分清洗 3次，每次 3min； ? 4. 用 3%戊二醛 固定 20min； ? 5. 用 PBS清洗 3次，每次 10min； ? 6. ％考馬斯亮蘭 R250染色 2030min； ? 7. 用 蒸餾水 清洗 12次； ? 8. 壓片，鏡檢。 ? 結(jié)果微絲束呈深藍色 五 、實驗結(jié)果 洋蔥內(nèi)表皮細胞骨架的考馬斯亮蘭染色結(jié)果 洋蔥鱗莖外層與內(nèi)層的內(nèi)表皮細胞比較（放大倍數(shù) 10 20） 左：鱗莖外層（對照）；右鱗莖內(nèi)層
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