westernblot實(shí)驗(yàn)技術(shù)(1)-資料下載頁
2025-05-11 00:52本頁面
【正文】 一段時(shí)間使用。忌即配即用或 4度冰箱放置，前者易導(dǎo)致凝固不充分，后者可導(dǎo)致 SDS結(jié)晶。一般凝膠可在室溫下保存 4天， SDS可水解聚丙烯酰胺。 ? “ 微笑 ”（兩邊翹起中間凹下）形帶原因？ 主要是由于凝膠的中間部分凝固不均勻所致，多出現(xiàn)于較厚的凝膠中。 處理辦法：待其充分凝固再作后續(xù)實(shí)驗(yàn)。 ? “皺眉 ”（兩邊向下中間鼓起）形帶原因？ 主要出現(xiàn)在蛋白質(zhì)垂直電泳槽中，一般是兩板之間的底部間隙氣泡未排除干凈。 處理辦法：可在兩板間加入適量緩沖液，以排除氣泡。 ? 為什么溴酚藍(lán)不能起到指示作用？ 我們?cè)趯?shí)驗(yàn)中常會(huì)遇到溴酚藍(lán)已跑出板底，但蛋白質(zhì)卻還未跑下來的現(xiàn)象。主要與緩沖液和分離膠的濃度有關(guān)。 處理辦法：更換正確 pH值的 Buffer；降低分離膠的濃度。 ? 為什么電泳的條帶很粗？ 電泳中條帶很粗是常見的事，主要是未濃縮好的原因。 處理辦法：適當(dāng)增加濃縮膠的長(zhǎng)度；保證濃縮膠貯液的 pH正確（ ）；適當(dāng)降低電壓； ? 電泳時(shí)間比正常要長(zhǎng)？ 可能由于凝膠緩沖系統(tǒng)和電級(jí)緩沖系統(tǒng)地 PH選擇錯(cuò)誤，即緩沖系統(tǒng)地PH和被分離物質(zhì)的等電點(diǎn)差別太小，或緩沖系統(tǒng)的離子強(qiáng)度太高。 初學(xué)者常見問題 ? 為什么電泳電壓很高而電流卻很低呢？ 比如電壓 50v以上，可電流卻在 5mA以下。主要是由于電泳槽沒有正確裝配，電流未形成通路。包括： ； ； 體未去掉（比如倒膠用的橡膠皮）。 ? 濃縮膠與分離膠斷裂、板間有氣泡對(duì)電泳有影響嗎？ 這主要出現(xiàn)在初學(xué)者中，一般對(duì)電泳不會(huì)有太大的影響。前者主要原因是拔梳子用力不均勻或過猛所致；后者是由于在解除制膠的夾子后，板未壓緊而致空氣進(jìn)入引起的。 ? 凝膠時(shí)間不對(duì)，或慢或快，怎么回事？ 通常膠在 30min1hr內(nèi)凝。如果凝的太慢，可能是 TEMED， APS劑量不夠或者失效。 APS應(yīng)該現(xiàn)配現(xiàn)用， TEMED不穩(wěn)定，易被氧化成黃色。 如果凝的太快，可能是 APS和 TEMED用量過多，此時(shí)膠太硬易裂，電泳時(shí)易燒膠。 轉(zhuǎn)膜及抗體檢測(cè) 凝膠腫脹或卷曲？ 條帶歪斜或漂移？ 單個(gè)或多個(gè)白點(diǎn)？ 轉(zhuǎn)膜緩沖液過熱 ？ ? 可將凝膠在轉(zhuǎn)膜之前放到轉(zhuǎn)膜緩沖液中浸泡 510min ? 電轉(zhuǎn)儀長(zhǎng)期使用導(dǎo)致海綿變薄， “ 三明治 ” 結(jié)構(gòu)不緊湊導(dǎo)致?？稍趦蓧K海綿之間墊上少許普通的濾紙 ? 確保膜和膠塊之間沒有氣泡 ? 緩沖液中離子濃度太低，電流或電壓太高。轉(zhuǎn)膜過程注意降溫 背景太高 1. 膜沒有均勻浸濕 2. 膜或者緩沖液污染 3. 封閉不充分 4. 抗體與封閉劑出現(xiàn)交叉反應(yīng) 5. 抗體濃度過高 原因 對(duì) 策 1. 轉(zhuǎn)膜前用 100%甲醇將膜完全浸濕 2. 拿取膜與吸水紙時(shí)要戴手套，更換新鮮轉(zhuǎn)膜緩沖液 3. 檢測(cè)一抗、二抗與封閉劑是否有交叉反應(yīng) 4. 雜交前檢測(cè)一抗、二抗的工作濃度 THANKS!
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