實(shí)驗(yàn)基本技術(shù)ppt課件-資料下載頁
2025-04-29 00:24本頁面
【正文】 v Mg++PCR PrimersPCR Primers? 序列發(fā)現(xiàn)的時(shí)間和發(fā)現(xiàn)者? 序列的生物體來源? 序列的組織來源引物設(shè)計(jì)v 引物長度（ length） : 20～ 30bpv 引物中四種堿基的分布應(yīng)該是隨機(jī)的v 兩引物間不能有互補(bǔ)序列，尤其是 3‘端v 引物的堿基順序不應(yīng)與非擴(kuò)增區(qū)域由同源性v 引物的 3’末端堿基一定要與模板 DNA配對(duì)v 可以在 5’末端加上限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)或起始密碼v 解鏈溫度 (Tm)：兩引物間相差不大于 5℃v 引物內(nèi)部不能有大于 3bp的反向重復(fù)序列或自身互補(bǔ)序列存在PCR基本程序v預(yù)變性（ Predenaturation)v變性 (Denaturation)v退火 (Annealing)v延伸 (Elongation)v2530 cyclesPCR反應(yīng)v 取無菌 0?2ml PCR管一支，加入：v 10?PCR緩沖液 5μlv 氯化鎂 4μlv 4種ｄ NTP混合液 (10mmol/L) 0?5μlv 3?端引物 (10μmol/L) 1μlv 5?端引物 (10μmol/L) 1μlv Taq DNA多聚酶 (5u/μl) 0?25μlv 三蒸水 33?25μlv 模板 cDNA 5μlv 蓋緊蓋子，離心數(shù)秒后置 PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增。 PCR循環(huán)為： 95℃ 預(yù)變性 2 min， 95℃ 變性30 s、 55℃ 復(fù)性 30 s、 72℃ 延伸 1 min， 30個(gè)循環(huán)，最后 72?C延伸 7 min。細(xì)胞裂解RNA釋放釋放 cDNA PCR擴(kuò)增擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶耐熱耐熱DNA聚合酶聚合酶RTPCR擴(kuò)增擴(kuò)增引物dNTPs二價(jià)金屬離子DNA聚合酶引物dNTPs二價(jià)金屬離子逆轉(zhuǎn)錄酶RTPCR過程逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄酶 /耐熱耐熱 DNA聚合酶聚合酶瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)瓊脂糖凝膠電泳基本原理v 瓊脂糖凝膠電泳是以瓊脂糖作為固體支持物的一種電泳方法。v 因?yàn)楦鞣N核酸分子的電荷及質(zhì)量之比是相近的，在沒有支持物的電場(chǎng)中，它們以相同的速度前進(jìn)。v 瓊脂糖凝膠電泳具有分子篩效應(yīng)，所以在適當(dāng)濃度的瓊脂糖凝膠中電泳，線性 DNA分子在電場(chǎng)中的遷移率與其分子量的對(duì)數(shù)成反比，從而達(dá)到分離的目的。瓊脂糖凝膠電泳分離的原理v 使 TAE浸過凝膠表面v 在陰極的加樣孔加樣（紅正黑負(fù)）v 分子篩作用v 分子量越小，遷移速度越快瓊脂糖凝膠的濃度與 DNA分離范圍Separation Range Vs. % Agarose瓊脂糖凝膠濃度與分離效率大片段在大片段在 %瓊脂瓊脂糖凝膠中分離效果好糖凝膠中分離效果好 小小 片段在片段在 %瓊脂瓊脂糖凝膠中分離效果好糖凝膠中分離效果好上樣v上樣緩沖液v甘油可 增加樣品密度，使其比重增加，以確保 DNA均勻沉入加樣孔內(nèi)v在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預(yù)測(cè)核酸電泳的速度和位置v使樣品呈色，使加樣操作更方便vEDTA, SDS 可滅活限制性內(nèi)切酶溴化乙錠 ( EB)染色EB堆砌在堆砌在 DNA雙螺旋的堿基對(duì)之間DNA 分子越小 ,結(jié)合的EB 越少 ,染色越淡溴化乙錠是一種熒光染溴化乙錠是一種熒光染料料 ,可嵌入核酸雙鏈的可嵌入核酸雙鏈的堿基對(duì)之間，在紫外堿基對(duì)之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光，常用熒光，常用 + +注意事項(xiàng)v一定要等凝膠冷卻至 60℃ 時(shí)再入加溴化乙錠v切記 DNA樣品由負(fù)極往正極泳動(dòng) (靠近加樣 孔的一端為負(fù) ) v加完樣品后最好先觀察一段時(shí)間v插電極或拔電極時(shí)必須將儀器電源關(guān)掉v不要使樣品跑出凝膠謝
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