【正文】 基酸序列特異性，有些是識別構(gòu)像特異性。所以一般根據(jù)抗體說明書來確定。 七、檢測到的抗原分子量是資料上的兩倍，是怎么回事？ 答：抗原形成了二聚體。增多 β 巰基乙醇的量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。 八、做 western必須要內(nèi)參嗎？ 答：內(nèi)參起著校正總蛋白上樣量的重要作用，只有在內(nèi)參條帶基本均勻一致的情況下，目的蛋白條帶出現(xiàn)的差異才有意義 ,表明的確是實驗設(shè)計的干預(yù)因素造成目的蛋白量的變化，而不是加樣誤差造成目的條帶含量的變化 .所以內(nèi)參是必須做的。 MOLECULAR AND CELLULAR BIOLOGY, May 2022, – 3574 內(nèi)參即是內(nèi)部參照，對于哺乳動物細胞表達來說一般是指由管家基因編碼表達的蛋白，它們在各組織和細胞中的表達相對恒定，一般要選擇一個在處理因素作用的條件下蛋白含量不會發(fā)生改變的蛋白作內(nèi)參。 內(nèi)參名稱 分子量大小 適用范圍 Tubulin 55kD 胞漿和全細胞 VCDA1/Porin 31kD 線粒體 COXIV 16kD 線粒體 Lamin B1 66kD 細胞核 TBP 38kD 細胞核 八、非特異條帶多 答： 1 抗體特異性不夠，考慮使用單抗，保證抗體的特異性； 2 蛋白降解，應(yīng)盡量使用新鮮制備的樣品，提取后一定要分裝，避免反復(fù)凍融。 九、曝光后出現(xiàn)反像 答： HRP含量過高導(dǎo)致，建議降低二抗的使用濃度 免疫熒光技術(shù)（ immunofluorescence ， IF） ? 定義： 將免疫學(xué)方法 (抗原抗體特異結(jié)合 )與熒光標記技術(shù)結(jié)合起來研究特異蛋白抗原在細胞內(nèi)分布的方法。 ? 原理： 根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標記上熒光素制成熒光標記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測定含量。 3T3 Line PtK1 Line NBL6 Line RK13 Line Longitudinal Fissure Blood Vessels Cerebellum 定位 直接法：熒光素標記的特異性抗體直接與相應(yīng)抗原反應(yīng)。 間接法：特異性抗體與相應(yīng)抗原反應(yīng)，熒光素標記的抗抗體再與第一抗體結(jié)合。 分類 實驗方法 ? 將培養(yǎng)好的貼壁細胞用 PBS輕輕漂洗 2次 (PBS提前置室溫 )，避免細胞脫落； ? 4%多聚甲醛室溫固定 30min (靜置 )； ? PBS涮洗 3次，然后搖床緩慢搖洗 5min 3次； ? % Triton100室溫緩慢搖 30min，涮洗 3次； ? 用與二抗同源的血清（ 10%），室溫緩慢搖晃封閉 1h ，置濕盒內(nèi)； ? 用燒杯裝 PBS，涮洗玻片一次； ? 用紙將 PBS吸干后，滴加一抗（約 100 ul）， 4度過夜，置濕盒中。鼠抗 LRP16（ 1： 100），兔抗 p65（ 1： 150）； ? PBS涮洗３次，搖床搖洗 10min ３次； ? 用紙將 PBS洗干后，滴加二抗（羊抗鼠 FITC[1： 200］，羊抗兔 594［ 1：600］） ,濕盒，避光！室溫２ h，加二抗以后所有操作均應(yīng)避光； ? DAPI染核７ min（用 PBS按 1： 2500稀釋）； ? PBS涮洗３次，搖床慢速搖洗 10min ３次； ? 封片：甘油－ PBS（ 1： 1），每張片子約需 13ul； ? 共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果或 20度保存。 結(jié)果判斷 ? 設(shè)立實驗對照 :陽性對照和陰性對照 ? 陽性細胞顯色分布 :胞質(zhì)型、胞核型和膜表面型 免疫學(xué)三大工具比較 ? 免疫熒光 是融合了免疫學(xué)原理（抗原抗體特異性結(jié)合）和熒光標記技術(shù)，通過熒光激發(fā)，來對組織（細胞）內(nèi)抗原進行定位、定性及定量的研究 (主要是定位 )。樣本是細胞或組織，要在顯微鏡下觀察結(jié)果，可能出現(xiàn)膜陽性、質(zhì)陽性和核陽性。 ? ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗） 用到了免疫學(xué)原理和化學(xué)反應(yīng)顯色，待測的樣品多是血清、血漿、尿液、細胞或組織培養(yǎng)上清液，因而沒有用到組織包埋、切片等技術(shù)，這是與免疫組化的主要區(qū)別，操作上 開始需要將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面，從而使后來形成的抗原 抗體 酶 底物復(fù)合物粘附在載體上，這就是“吸附”的含義。 ? 免疫組化和 elisa所用到的原理 大致相同，只是因為所檢測的樣品不同，從而在操作方法上有所不同。 ELISA多用于定量分析，其靈敏度非常高。 ? western bolt 先要進行 SDSPAGE，然后將分離開的蛋白質(zhì)樣品用電轉(zhuǎn)儀轉(zhuǎn)移到固相載體上，而后利用抗原 抗體 標記物顯色來檢測樣品，可以用于定性和半定量。 ELISA與 western blot比較 ? western blotting 可以看到特異性的條帶，但是定量比較麻煩 ? ELISA可以直接讀出濃度，但是如果抗體有非特異性結(jié)合，那得到的數(shù)值就不可信； ? WB只能半定量 ,但是可以檢測細胞膜蛋白 ,這點 ELISA做不到； ? WB所檢測的一般是抗原，而 ELISA抗原抗體都可以檢測； ? WB所檢測的抗原可以知道其分子量的大小，或是否是多聚體、降解產(chǎn)物等，一句話， WB可以確定所用抗體是與那種蛋白起作用的；而 ELISA無能為力； ? WB一次處理量就是一塊膠版， 1020個樣品最多了。 ELISA一塊 96孔板一次可以處理 96個樣本，可以設(shè)置多個復(fù)孔、對照、梯度樣等來提高檢測的可信度； 免疫共沉淀（ CoIP) ? 用抗體將相應(yīng)特定分子沉淀的同時，與該分子特異性結(jié)合的其他分子也會被帶著一起沉淀出來的技術(shù)。這種技術(shù)常用于驗證蛋白質(zhì)之間相互特異性結(jié)合。 染色質(zhì)免疫共沉淀（ ChIP) ? 染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ chromatin immunoprecipitation assay, ChIP）是目前唯一研究體內(nèi) DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。它的基本原理是在活細胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)－ DNA復(fù)合物，并將其隨機切斷為一定長度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合體，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的 DNA片段，通過對目的片斷的純化與檢測，從而獲得蛋白質(zhì)與 DNA相互作用的信息。 購買抗體時要注意廠商的標注 適合于做什么實驗 ,使用濃度多少 ? WB（ Western blotting ，免疫印跡 ) ? IH (Immunohistochemistry, 免疫組織化學(xué) ) ? IC (Immunocytochemistry, 免疫細胞化學(xué) ) ? IEM (Immune lectron microscopy,免疫電鏡 ) ? FCM (Flow Cytometry,流式細胞儀 ) ? ELISA(enzyme linked immunosorbent assey, 酶聯(lián)免疫吸附實驗 ,酶聯(lián)免疫分析 ) 舉例 復(fù)習(xí)思考題 ? 簡述 IF、 western blot、 ELISA的在應(yīng)用中的區(qū)別。