【導讀】六、HE染色及試劑配制………

　　

【正文】 topsy）?；顧z組織標本和細胞學標本可按年份編排，如 B990001 和C990001； 也可用連續(xù)編號（流水編號） 如 B0001 和 C0001。尸檢可用連續(xù)編號（流水編號）。動物實驗標本一般臨時編號。編號后按登記本所列項目進行登記，將標本按順序放在規(guī)定的地方，以備檢查，不得遺失。 病理申請單 凡有下列 1～ 6 項 情況之一者，應及時責其更正或退回。 可 記錄該問題，按要求呈報醫(yī)務科。 1. 標本是否放入容器內(nèi)。有否 存在 主要病灶被事先挖取或一個標本被分送兩個單位（不允許本院標本無故送往外院或隨便丟棄） 。 2. 容器中是否有雜物。容器上是否貼有標簽。 3. 固定液量是否充足。有否標本嚴重自溶、干涸、腐敗或被錯誤地使用非固定液浸泡。 4. 固定液用 10%中性福爾馬林溶液 ， （ 10%中性 福爾馬林溶液 可由藥房配制，各臨床科領用即可 ） 。 5. 申請單是否清潔。填寫是否完整，有否重要項目空缺或 填寫的 病史及臨床檢查過于簡單。 6. 申請單填寫內(nèi)容是否與標本相符，字跡是否工整。 7. 核實無誤后，進行編號、登記或用微機錄入。 8. 大標本，可在不影響主要病灶的情況下 測量、描述并 剖開固定，并適當添加固定液， 繼續(xù) 固定。 二、組織取材 程序及 質(zhì)量控制 各種臟器有其獨特的大體結構，各種疾病又有其各自的特點。即使同一種疾病，在不同的病例亦可有不同的發(fā)病部位、肉眼形態(tài)及發(fā)展階段。因 此，在肉眼檢查各種臟器的各種病變時，既要有規(guī)范的常規(guī)檢查方法，又要有按照不同情況決定檢查方法的靈活性?？偟脑瓌t如下： 標本的大體檢查及取材應按編號順序進行 ， 檢查前應閱讀申請單上各項主要內(nèi)容 ， 注意臨床醫(yī)生有無特殊要求。然后取出全部標本進行核對，發(fā)現(xiàn)問題及時解決，必要時請臨床醫(yī)師前來辨認標本，確認無誤后再進行檢查、取材（有色標本瓶應仔細查看 ， 防止小塊標本遺留在瓶內(nèi)）。 肉眼檢查的一般原則可概括為看、觸、切、取。較詳細地描寫標本大小、形狀，表面和切面的顏色、硬度、病變部位、大小、形狀、特點和周圍組織的關系等。某些 器官如甲狀腺、腎 上腺 、脾臟及某些腫瘤等要 稱 其 重量。先描寫主要病變、后描寫次要病變。必要時繪圖說明。剖檢標本時，應注意暴露標本的最大面積，以便全面檢查，并應保留其特點，（三級以上醫(yī)院）以備作為教學和科研之用。 具體要求 如下： 21 1. 大體標本取材，應有 2 人參加。記錄者（一般為技術人員）應詳細記錄取材者的口頭描述，負責宣讀申請單。尤其要告訴取材者標本的件數(shù)、臨床的特殊要求，并對取材者放置的小號碼進行監(jiān)督。取材者應在聽宣讀時，對標本容器上的編號、姓名及標本數(shù)量作第二次核實，如發(fā)現(xiàn)問題，待與臨床醫(yī)師聯(lián)系、認定后再取材 。 2. 小件標本 應 每塊均取材 制做 切片，可能時每塊保存一部分，以備重復檢查之用；若標本太小，如窺鏡咬檢標本，應全部取材 ，點染伊紅 并用 軟 紙包裹，以防遺失。 3. 腫瘤尤其是惡性腫瘤標本，除了在腫瘤部位取組織塊之外，還要在被手術切除的斷端及病變邊緣（腫瘤與周圍組織交界處）等部位取組織塊進行檢查。局部淋巴結必須逐個進行切片檢查，以便明確腫瘤侵犯范圍和轉移率的情況。（可參考第 七 章） 4. 組織塊取材厚度 以不超過 3mm 為宜，且要平整，并須注明其形狀、數(shù)目、切取部位（如左、右、上、下等），如有特殊情況，應向技術人員交 代清楚，或共同處理。 5. 在標本取材時，每一例標本取好之后，剩余的標本，應放回原送檢容器中妥善保存，直到發(fā)出病理報告之后 2 周 無問題 再行處理。 6. 每一例標本取好之后都應附上標本來源號，不同號碼的標本，必須分別放于不同的脫水盒中，記錄塊數(shù)，特點及制片時注意事項，要認真與 申請單 核對，防止張冠李戴，然后放入脫水機中脫水。用特殊固定液固定的標本，制片時 需 特別處理時應向技術人員交代清楚。骨組織和 需 鈣化的組織應進行脫鈣處理。 7. 有下列情況之一者，應編寫小序號號碼并與相應的組織塊 放在一起 ，切勿放錯：① 一位病員被送 一件以上的標本。 ② 申請單中注明有特殊標記的標本。 ③ 一個大標本多處取材。 ④ 根治術標本的基部及切緣，找出或送檢的淋巴結。 ⑤ 補充取材。 8. 每件標本取材后，應用流水沖洗 ， 紗布擦 試取 材臺及用具，必須 清理 干凈后再取下一例標本，防止標本間的組織碎屑污染，造成誤診。取材 結束后， 病理醫(yī)師應向技術 人員 當面交付組織塊；技術人員點清塊數(shù)，取材者和記錄者應分別在記錄單的適當位置簽名 。技術人員檢查病理醫(yī)師為技術室所提供的材料是否合格 ： 組織塊數(shù)的確認、標本大小、厚度（取材塊一般要求在 以下）、脫鈣情況 、特殊固定等，清點后接收—— 交接班。 9. 所 用的器械要用 戊二醛消毒 溶液浸泡消毒（或定期高溫消毒），工作臺面和取材板可用 ～ %過氧乙酸溶液擦拭消毒，此外 可 用紫外線對取材室進行空氣和物體表面消毒 。 室內(nèi)用紫外線消毒時應清潔、干燥，溫度不低于 20℃ ，相對濕度不超過 50%。照射劑量不應低于 90000 微瓦秒 /cm2, 一般照射 20～ 30 分鐘 。 三、組織處理、包埋 程序及 質(zhì)量控制 組織固定、脫水、透明、浸蠟直至包埋，是制作優(yōu)質(zhì)切片的關鍵過程 。該 過程 也 稱為組織處理 。 一旦組織處理有欠缺，往往導致無法挽回的后果。 固定后 的 組織不能直接用蠟滲透，首先 要 脫去組織中的水分 。 通常經(jīng)過一系列的梯度乙醇脫水 ， 如 80%→95%→100% 。 第一步 也 可使用乙醇和福爾馬林混合液 。 也可以用其它脫水劑。丙酮脫水非?？?，但容易燃燒 ， 為了安全 ，只有 在手工處理組織時可少量使用。 22 大多數(shù)脫水劑不能與石蠟直接相溶，所以脫水后必須 再 經(jīng)過透明劑作用 ， 才能對組織進行浸蠟。最后用石蠟包埋組織塊。 透明劑 即 可以與脫水劑相溶又能和石蠟相溶 。 透明劑是脫水和浸蠟的媒介劑，在組織處理中起著橋梁作用，當組織被透明劑浸透后，組織呈透明狀態(tài)。透明劑作用于組織的過程，稱為組織 透明。最常用的透明劑是二甲苯。甲苯的作用非常好，組織中剩 余 少量水分也能使組織透明，但價格比二甲苯貴的多。使用氯仿透明對人的健康有危害。水楊酸甲脂也可以用于組織透明，但很少使用，主要是價格太貴。 組織經(jīng)過二甲苯透明后 ， 浸泡在熔化的石蠟中，組織浸蠟一般要通過 2～ 3 個蠟缸（蠟 蠟 蠟 3），最終以石蠟替換出組織中的透明劑。石蠟的熔點一般為 56～ 58℃， 浸蠟的溫度通常比蠟的熔點高 2℃ 左右 。 上述組織處理過程一般由脫水機自動處理（也可手工操作）。組織在脫水機中從一個缸內(nèi)移到另一個缸內(nèi)，從一種試劑移到另 一 種試劑 中，完全按照預先設置的時間和溫度程序自動完成。高檔的脫水機是由電腦控制，對試劑的密閉效果好，具有真空和加熱功能，使組織的處理更加完善。 組織處理 的質(zhì)量控制： 1. 組織的處理時間，視組織的性質(zhì)和組織塊的大小而有所不同。致密的組織、富含脂肪或纖維組織，處理所需的時間要比結構細膩、細胞成分多的組織長。最好能根據(jù)組織的性質(zhì)和大小分類，分批進行處理，以便于掌握時間，保證質(zhì)量。 2. 較細小的組織，例如內(nèi)窺鏡鉗取標本，穿刺標本，應與較大的組織塊分別進行處理。小組織濾紙包裹或者裝入專用的網(wǎng)狀脫水盒內(nèi)，以免遺失。 3. 組織處理所用的各種試劑，可根據(jù)工作量的大小，試劑消耗情況定時更換新液。一般情況下一月更換一次。 使用 脫水機的 參考 程序： 程序一 ： 下午下班前運行脫水機。第二天上午 8 時開始包埋。 時間 試劑 17:00 運行 1 17:45 出 10％ 中性 福爾馬林溶液 2 18:30 出 10％ 中性 福爾馬林溶液 3 20:00 出 80%乙醇 4 21:00 出 90%乙醇 5 23:00 出 95%乙醇 6 24:00 出 95%乙醇 7 1:30 出 100%乙醇 8 3:00 出 100%乙醇 9 3:30 出 二甲苯 10 4:00 出 二甲苯 23 11 5:30 出 石蠟（ 54℃ ） 12 8:00 出 石蠟（ 58℃ ） （蠟缸溫度 62℃ ） 程序二 ： 時間 試劑 16： 00 運行 1 16:45 出 10％ 中性 福爾馬林溶液 2 17:30 出 10％ 中性 福爾馬林溶液 3 18:00 出 80%乙醇 4 19:30 出 90%乙醇 5 22:00 出 95%乙醇 6 22:30 出 95%乙醇 7 0:30 出 無水乙醇 8 2:30 出 無水乙醇 9 3:00 出 二甲苯 10 3:30 出 二甲苯 11 4:30 出 石蠟 (58℃ ) 12 5:30 出 石蠟 (58℃ ) 13 7:30 出 石蠟 (58℃ ) 上述脫水、浸蠟及時間控制程序是經(jīng)過長期的實際工作總結，并適合免疫組化的質(zhì)量要求 ， 一年四季的溫度、濕度變化等編制而成的。其中考慮到每種化學試劑的具體作用 ，特性和取材類型，在實際的工作應用中其效果，原則上滿意，可以保證常規(guī)切片的質(zhì)量。如今后有工作人員需要對上述脫水、浸蠟時間程序改動，除了要考慮到上述因素之外，先提交申請，申明改動的理由及改進原理，經(jīng)科主任批準后，可以開始批量試驗。在新程序不成熟以前，不準日常工作應用！待批量結果實驗以后，經(jīng)全科工作人員對此進行評估，決定應用與否。如違 背此規(guī)定，擅自改動者，為第一責任人，出現(xiàn)差錯 者 應受相應的處分。 工作中自動脫水機使用時的注意事項： 1. 按脫水、透明、浸蠟順序設置試劑缸，缸的位置要準確，使標本掛籃升降轉換時準確落入下一級缸內(nèi) 。 2. 保持各試劑缸內(nèi)的試劑液面有足夠的高度，以使組織全部侵入液體內(nèi)。 3. 按設計好的組織處理時間表，調(diào)定時間控制裝置。 4. 調(diào)定浸蠟缸溫度，一般要高出所用石蠟熔點溫度 2℃ 左右 。 5. 將盛有組織塊的掛籃掛于升降架的掛鉤上，使之落入第一個脫水缸內(nèi)，啟動機器后開始計時運轉。 6. 當完成最后一道程序后，應及時取 出標本進行包埋（必要時隨手關機）。 組織包埋程序 1. 包埋劑及其使用范圍：用于組織包埋的材料有石蠟、碳蠟、火棉膠和各種塑料（甲 24 基丙烯酸甲酯，環(huán)氧樹脂， Epon 等）。石蠟是最常用的組織包埋劑 。 甲基丙烯酸甲酯的硬度很強，多用于未脫鈣骨組織的包埋。環(huán)氧樹脂和甲基丙烯酸甲酯同樣需要更復雜的包埋處理過程。 Epon 主要用于電鏡組織的包埋。碳蠟包埋的主要優(yōu)點是不經(jīng)過脫水與透明處理，故組織塊收縮較少，所以特別適用于脂肪及類脂的制片。火棉膠主要用于大塊組織和眼球的包埋，對研究神經(jīng)組織和眼球等有一定的幫助。塑料包埋需要特殊試 劑脫水和透明，全過程必須手工操作。塑料包埋多用于骨髓穿刺，腎穿刺和肝穿刺等小塊組織的包埋。石蠟包埋是一種常規(guī)包埋法，組織從脫水機中取出后仍在脫水盒內(nèi)，必須人工將組織從脫水盒中取出來，然后放進包埋框里排列整齊，調(diào)整好方位，再灌滿（ 62℃ ）熔化的石蠟。 2. 包埋步驟： （ 1）包埋 時的 用蠟 需 預先熔化，充分沉淀后使用。 （ 2）將 熔 蠟注入蠟模內(nèi)，將鑷子在酒精燈上加溫，夾持浸好蠟的組織塊，選擇好包埋面，將其朝下埋入熔蠟內(nèi)，用鑷子輕輕按壓，使組織在蠟中并緊貼蠟 模 底部。隨即將組織 塊號碼簽嵌入熔蠟的一側。 （ 3）待熔蠟表面 凝固后， 可 投入流水中 、 放進冰箱冷凍室 或包埋機冷臺上 促凝。 （ 4）待蠟完全凝固后脫模，并把蠟塊四周適當修切。組織周圍應留有 1~2mm 的蠟邊。提倡使用石蠟包埋機，質(zhì)量更好！ 3. 包埋面的選擇： （ 1）一般情況下以組織最大面為包埋面。 （ 2）管狀結構的組織以橫切面為包埋面。 （ 3）皮膚組織或有表層上皮的組織，包埋面應垂直于上皮表面。 （ 4）帶有病變特點的組織，或者對包埋面有特別要求的組織應按預先標記的包埋。 組織處理、包埋 程序的質(zhì)量控制： 1. 取材后對固定不充分的組織，應補充固定（固定時間：大標本固定時間不得 少于18 小時；小標本不得少于 6 小時。固定液必須定時更換（ 標本 固定時間過長者，應流水沖洗）；有條件的單位應將大 、 小標本分開固定、脫水。 2. 固定、脫水溫度不得高于 37℃ 。 3. 試劑必須定時更換。（詳見試劑的配制及更換）。 4. 包埋用石蠟必須定期過濾，蠟溫應控制在 62℃ 左右 。 5. 包埋時應嚴格分塊包埋，并同時包入相應的小號，切勿包錯。不得將來歷不明的碎組織塊任意包入，以防污染。 6. 組織包埋完成后必須進行清點蠟塊數(shù)量，以防組織塊在脫水、包埋過程中遺失 。 四、 組織切片 程序及 質(zhì)量控制 石蠟切片程序： 組 織包埋后必須切成薄片，再貼到載玻片上。 需使用的設備： 切片機、切片刀、水浴鍋或撈烤片機等。切片機多為輪轉式，也有滑動式石蠟切片機。切片機的壽命一般