【導(dǎo)讀】研究工作所取得的成果。除文中已注明引用的內(nèi)容外，本畢業(yè)設(shè)計（論文）不包。含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本研究做出過重要貢獻(xiàn)。的個人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明并表示了謝意。抑制,調(diào)節(jié)靶基因的表達(dá)。miRNA對動植物的生長、發(fā)育等各種生命活動發(fā)揮著。至關(guān)重要的調(diào)節(jié)作用。通常多個miRNA基因在染色體上聚集排列形成miRNA基。miRNA所參與的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。miR-430簇分布在斑馬魚4號染色體上約20kb的一個區(qū)域內(nèi)，三個miRNA. 組成了三聯(lián)體，并以此為基本單元進(jìn)行復(fù)制。本課題主要開展miR-430基因簇分子進(jìn)化分析研究。數(shù)據(jù)庫中獲得數(shù)據(jù)，即已知的mir-430基因的成熟序列。根據(jù)斑馬魚、青鳉、紅鰭。進(jìn)行搜索，利用BLAST軟件進(jìn)行相似性比較的分析。漸進(jìn)的多序列比對。利用MEGA，以mir-430基因簇中的mir-430成員成熟序。列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。因簇的起源及相關(guān)物種的進(jìn)化關(guān)系，為其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供理論基礎(chǔ)。

　　

【正文】 Rhipicephalus microplus [微小扇頭蜱 ] (24)， Ascaris suum [豬蛔 蟲 ] (97)， Glottidia pyramidata (1)， Terebratulina retusa (1)。 ? 病毒： Herpesvirus saimiri strain A11 (3)。 miRBase 提供便捷的網(wǎng)上查詢服務(wù)，允許用戶使用關(guān)鍵詞或序列在線搜索已知的 miRNA 和靶標(biāo)信息，可以供我們方便的使用里面的信息。 NCBI NCBI(美國 國立生物技術(shù)信息中心 )理解自然無聲但精妙的關(guān)于生命細(xì)胞的語言是現(xiàn)代分子生物學(xué)的要求。通過只有四個字母來代表 DNA 化學(xué)亞基的字母表，出現(xiàn)了生命過程的語法，其最復(fù)雜形式就是人類。闡明和使用這些字母來組成新的 “單詞和短語 ”是分子生物學(xué)領(lǐng)域的中心焦點。數(shù)目巨大的分子數(shù)據(jù)和這些數(shù)據(jù)的隱秘而精細(xì)的模式使得計算機化的數(shù)據(jù)庫和分析方法成為絕對的必須。挑戰(zhàn)在于發(fā)現(xiàn)新的手段去處理這些數(shù)據(jù)的容量和復(fù)雜性，并且為研究人員提供更好的便利來獲得分析和計算的工具，以便推動對我們遺傳之物和其在健康和疾病中角色的理解。 NCBI 的項目包括四項任務(wù)：建立關(guān)于分子生物學(xué)，生物化學(xué)，和遺傳學(xué)知識的存儲和分析的自動系統(tǒng)；實行關(guān)于用于分析生物學(xué)重要分子和復(fù)合物 的結(jié)構(gòu)和功能的基于計算機的信息處理的，先進(jìn)方法的研究；加速生物技術(shù)研究者和醫(yī)藥治療人員對數(shù)據(jù)庫和軟件的使用；全世界范圍內(nèi)的生物技術(shù)信息收集的合作努力。 NCBI 首先創(chuàng)建 GenBank 數(shù)據(jù)庫 ，在重點開發(fā) GenBank 的同時，又于 1991年開發(fā)了 Entrez 數(shù)據(jù)庫檢索系統(tǒng)。該 系統(tǒng)整合 了 GenBank、 EMBL、 PIR 和SWISSPROT 等數(shù)據(jù)庫的序列信息以及 MEDLINE 有關(guān)序列的文獻(xiàn)信息，并通過相關(guān)鏈接，將他們有機地結(jié)合在一起。 NCBI 還提供了其它數(shù)據(jù)庫，包括在線人類 孟德爾 遺傳（ OMIM）、三維蛋白結(jié)構(gòu)的分子模型數(shù)據(jù)庫（ MMDB）、人類 基因序列集成（ UniGene）、 人類基因組 基因圖譜（ GMHG）、生物門類（ Toxonomy) 等數(shù)據(jù)庫。 NCBI 數(shù)據(jù)庫的檢索方法很簡單，在檢索框中輸入檢索詞，檢索詞間默認(rèn)邏輯關(guān)系為 AND，檢索規(guī)則基本同 PubMed?？梢酝ㄟ^下拉菜單選擇記錄的顯示格式，通常選擇 GenBank Report 格式或 FASTA Report 格式。當(dāng)選擇 GenBank Report格式后，屏幕顯示較完整的 基因 記錄，其內(nèi)容包括： 基因位點 （ Locus）、基因定義（ Definition） 、基因存取號（ Accession)、 核酸編號（ NID ）、關(guān)鍵詞（ Keywords）、 南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 14 來源（ Source）、組織分類（ Organism）、參考文獻(xiàn)（ Reference）、 著者（ Author）、題目（ Title）、期刊 Journal）、 Medline 存取號（ Medline）、序列特征（ Features）、基因（ Gene）、 CDS(cDNA）、 等位基因 （ Allele) 對等的肽（ MatPeptide ）、計算 堿基 數(shù)（ Base Count）、原序列（ Origin）。而 FASTA Report 格式僅包括檢出序列的簡要特征描述。 BLAST 軟件 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或 DNA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較的分析工具。 BLAST 是由美國國立生物技術(shù)信息中心（ NCBI）開發(fā)的一個基于序列相似性的數(shù)據(jù)庫搜索程序。 BLAST 是 “ 局部相似性基本查詢工具 ” (Basic Local Alignment Search Tool)的 縮寫。 BLAST 軟件的主要功能是： BLAST 對一條或多條序列 (可以是任何形式的序列 )在一個或多個核酸或蛋白序列庫中進(jìn)行比對。 BLAST 還能發(fā)現(xiàn)具有缺口的能比對上的序列。 BLAST 是基于 Altschul 等人在 上發(fā)表的方法 ,在序列數(shù)據(jù)庫中對查詢序列進(jìn)行同源性比對工作。從 BLAST 發(fā)展到 NCBI 提供的 ， 已將有缺口的比對 序列也考慮在內(nèi)了。 BLAST 可處理任何數(shù)量的序列 ， 包括蛋白序列和核酸序列 ； 也可選擇多個數(shù)據(jù)庫但數(shù)據(jù)庫必須是同一類型的 ， 即要么都是蛋白數(shù)據(jù)庫要么都是核酸數(shù)據(jù)庫。所查詢的序列和調(diào)用的數(shù)據(jù)庫則可以是任何形式的組合 ， 既可以是核酸序列到蛋白庫中作查詢 ， 也可以是蛋白序列到蛋白庫中作查詢 ， 反之亦然。 GCG 及 EMBOSS 等軟件包中包含有五種 BLAST： BLASTP 是蛋白序列到蛋白庫中的一種查詢。庫中存在的每條已知序列將逐一地同每條所查序列作一對一的序列對比； BLASTX 是核酸序列到蛋白庫中的一種查詢。先將核酸序列翻譯成蛋白序列（一條核酸序列會被翻譯成可能的六條蛋白），再對每一條作一對一的蛋白序列比對； BLASTN 是核酸序列到核酸庫中的一種查詢。庫中存在的每條已知序列都將同所查序列作一對一地核酸序列比對； TBLASTN 是蛋白序列到核酸庫中的一種查詢。與 BLASTX 相反，它是將庫中的核酸序列翻譯成蛋白序列，再同所查序列作蛋白與蛋白的比對； TBLASTX 是核酸序列到核酸庫中的一種查詢。此種查詢將庫中的核酸序列和所查的核酸序列都翻譯成蛋白（每條核酸序列會產(chǎn)生 6 條可能的蛋白序列），這樣每次比對會產(chǎn)生 36 種比對陣列。 通常根據(jù)查詢序列的類型（蛋白或核酸）來決定選用何種 BLAST。假如是作核酸－核酸查詢，有兩種 BLAST 供選擇，通常默認(rèn)為 BLASTN。如要用TBLASTX 也可，但記住此時不考慮缺口。 南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 15 BLAST 適用于本地查詢。可以下載公共數(shù)據(jù)庫，對于該數(shù)據(jù)庫的更新和維護(hù)是必 不可少的。如果要直接到網(wǎng)上查詢也可以（即 NetBlast），但記住如果你認(rèn)為自己的序列很有價值的話，還是謹(jǐn)慎為宜。 CLUSTALW 軟件 Clustal 的基本思想是基于相似序列通常具有進(jìn)化相關(guān)性這一假設(shè)。比對過程中，先對所有的序列進(jìn)行兩兩比對并計算它們的相似性分?jǐn)?shù)值，然后根據(jù)相似性分?jǐn)?shù)值將它們分成若干組，并在每組之間進(jìn)行比對，計算相似性分?jǐn)?shù)值。根據(jù)相似性分?jǐn)?shù)值繼續(xù)分組比對，直到得到最終比對結(jié)果。比對過程中，相似性程度較高的序列先進(jìn)行比對，而距離較遠(yuǎn)的序列添加在后面。作為程序的一部分， Clusal可以輸出用于構(gòu)建進(jìn)化樹的數(shù)據(jù)。 相比于 blast 只進(jìn)行局部比對， clustalw 進(jìn)行全局比對 。 Clustal W 多序列比較模塊中的多序列比較算法依三個階段順序展開。 首先進(jìn)行所有序列之間的兩兩比較 ,計算出它們之間的分化距離矩陣；然后從分化矩陣中計算出作為指導(dǎo)多序列比較順序的樹狀分枝圖；最后根據(jù)樹狀分枝圖的分支關(guān)系 ,按照分化順序逐個地把序列加入多序列比較過程。 Clustal 所 支 持 的 數(shù)據(jù) 格 式包 括 EMBL/SWISSPROT 、 NBRF/PIR 、Pearson/FastA、 GCG/MSF，以及 Clustal 本身定義的格式。它的輸出格式可以是Clustal 格式，也可以是可用于 GDE、 Phylip、 GCG 等軟件的格式。 CLUSTALW 是一種漸進(jìn)的多序列比對方法，先將多個序列兩兩比對構(gòu)建距離矩陣，反應(yīng)序列之間兩兩關(guān)系；然后根據(jù)距離矩陣計算產(chǎn)生系統(tǒng)進(jìn)化指導(dǎo)樹，對關(guān)系密切的序列進(jìn)行加權(quán)；然后從最緊密的兩條序列開始，逐步引入臨近的序列并不斷重新構(gòu)建比對，直到所有序列都被加入為止。 MEGA 軟件 MEGA 的全稱是 Molecular Evolutionary Geics Analysis 分子進(jìn)化遺傳分析。 MEGA 可用于序列比對、進(jìn)化樹的推斷、估計分子進(jìn)化速度、驗證進(jìn)化假說等。 MEGA 還可以通過網(wǎng)絡(luò)（ NCBI）進(jìn)行序列的比對和數(shù)據(jù)的搜索。 隨著不同物種基因組測序的快速發(fā)展，產(chǎn)生了大量的 DNA 序列信息，這時就需要一種簡便而快速的統(tǒng)計分析工具來對這些數(shù)據(jù)進(jìn)行有效的分析，以提取其中包含的大量信息。 MEGA 就是基于這種需求開發(fā)的。 MEGA 軟件的目的就是提供一個以進(jìn)化的角度從 DNA 和蛋白序列中提取有用的信息的工具，并且，此軟件可以免費下載使用。 現(xiàn)在我們使用的是 MEGA4 的版本。它主要集中于進(jìn)化分析獲得的綜合的南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 16 序列信息。使用它我們可以編輯序列數(shù)據(jù)、序列比對、構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹、推測物種間的進(jìn)化距離等。此軟件的輸出結(jié)果資源管理器允許用戶瀏覽、編輯、打印輸入所得到的結(jié)果而且所得到的結(jié)果具有不同形式的可視化效果。此外，該軟件還能夠得出不同序列間的距離矩陣，這是他不同與其他分析軟件的地方。在計算矩陣方面有一些自己的特點： （ 1） 推測序列或者物種間的進(jìn)化距離 （ 2） 根據(jù) MCL(Maximum Composite Likeliood method)的方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹 （ 3） 考慮到了不同堿基替換的不同的比率，考慮到了堿基轉(zhuǎn)換和顛換的差別。 （ 4） 隨時可以使用標(biāo)注：所以的結(jié)果輸入都可以使用標(biāo)注，而且標(biāo)注的內(nèi)容 可以被保存，復(fù)制。 南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 17 第四章 miRNA430 基因分子進(jìn)化研究 近年來，關(guān)于 miRNA的研究已經(jīng)從識別 miRNA、闡明其作用機制，轉(zhuǎn)移到鑒定其功能。并且，隨著生物信息學(xué)的預(yù)測方法、原位雜交、過量表達(dá)、基因沉默技術(shù)等的發(fā)展，一些 miRNA 的功能已經(jīng)得到確認(rèn)。這些 miRNA 的作用遍及生命體的發(fā)生、生長、發(fā)育、分化、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、疾病和死亡的過程。絕大部分miRNA 都被認(rèn)為是高度保守的。但近期的研究表明， miRNA 家族并非一成不變，物種的進(jìn)化不斷有新的 miRNA 產(chǎn)生。 而且大部分這些新產(chǎn)生的 miRNA 都能迅速在種群中固定下來并受到很大的選擇壓力。到目前為止，雖然已經(jīng)有對于個別 miRNA 家族進(jìn)化研究的報道，但總體來說，人們對于 miRNA 的進(jìn)化特性還知之甚少。 miRNA430基因簇最早是在斑馬魚中發(fā)現(xiàn)的，該基因簇由 mir430a、mir430b、 mir430c、 mir430d 、 mir430e、 mir430f、 mir430i等成員組成，屬于較大的 miRNA基因簇。 miR430在早期胚胎發(fā)育中豐度最高，通過抑制和降解母源基因在母源調(diào)控向合資調(diào)控的轉(zhuǎn)換過程中起到重要作用，是一種負(fù)責(zé)清除母方并且含量較高的 miRNA。在本文中，我們以一個 miRNA430為線索，研究 ,miRNA 的部分進(jìn)化特性。我們發(fā)現(xiàn)新產(chǎn)生的 miRNA在其出現(xiàn)后的一段時期內(nèi)會經(jīng)歷一個近似中性進(jìn)化的過程，在序列上快速演變，隨后逐漸穩(wěn)定下來，并在進(jìn)化上趨于保守。同時 , 我們觀察到 miRNA 有系特 異性 (lineagespecific)的大規(guī)模復(fù)制現(xiàn)象，以及 miRNA 在串連復(fù)制后，旁系同源的 miRNA 前體可能會選擇其發(fā)卡環(huán)不同臂上的序列作為成熟體，從而大大增加了 miRNA 新功能產(chǎn)生的可能性。我們的這些觀察表明， miRNA 這一類重要的調(diào)控因子在進(jìn)化過程中是十分活躍的。 課題使用 分子進(jìn)化分析的方法。 主要的步驟：從 miRBase 數(shù)據(jù)庫中獲得數(shù)據(jù)，即各物種的 mir430 基因的 成熟 序列 。根據(jù)斑馬魚 、 青鳉、紅鰭 東方鲀 等物種 的 mir430 基因的 成熟 序列通過同源性對比的方法在所有動物物種中進(jìn)行搜索 ，利用 BLAST 軟件進(jìn)行相似性比較的分析。利用 CLUSTALW 軟件進(jìn)行漸進(jìn)的多序列比對。 利用 MEGA 軟件，以 mir430 基因簇中的 mir430 成員 成熟序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹 。 本課題的目的主要是根據(jù) miRNA 基因在物種間的保守性，利用生物信息學(xué)同源性搜尋、對比的方法，探討 miR430 基因簇的分子進(jìn)化規(guī)律，揭示 miR430基因簇的起源及相關(guān)物種的進(jìn)化關(guān)系，為其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供理論基礎(chǔ)。 南京郵電大學(xué) 2020 屆本科生畢業(yè)設(shè)計（論文） 18 數(shù)據(jù)與方法 數(shù)據(jù) 由于 mibase 數(shù)據(jù)庫中存在大量的基因數(shù)據(jù)，可以供我們使用。根據(jù)數(shù)據(jù)庫的信息，我們從中選取了包含 dre、 ola 和 pma 等物種，然后利用這三個物種的序列所謂 sequence，在 NCBI 的數(shù)據(jù)庫中搜索所有包含 mir430 的物種及其序列，按照設(shè)定的標(biāo)準(zhǔn)做了統(tǒng)計。 通過對 mibase 數(shù)據(jù)庫中各物種的 mir430 基因進(jìn)行搜索，在原有已經(jīng)研究的斑馬魚等物種外，還有 21 動物存在 mir430 基因簇。數(shù)據(jù)庫顯示，這些物種均有 mir430 基因以基因簇的形式存在，但不同的物種 mir430 基因簇的成員不同。 序列對比分析 方法 利用 BLAST 軟件對不同物種的 mir430 基因簇進(jìn)行相似性比較的分析。 利用 CLUSTALW軟件對不同物種的 mir430基因簇進(jìn)行漸進(jìn)的多序列比對。