g418篩選和單克隆挑取-資料下載頁(yè)
2025-08-12 09:49本頁(yè)面
【導(dǎo)讀】Q：G418怎么配制？度為100mg/ml完全溶解后，um過(guò)濾，－20度保存。萄糖，gHEPES,溶解，NaOH調(diào)PH至,定容至100ml。特別是當(dāng)細(xì)胞對(duì)G418不敏感，G418使用濃度高時(shí)，如果用水、PBS配置，會(huì)極大的改變細(xì)胞培養(yǎng)基的pH值，影響細(xì)胞的生長(zhǎng)。節(jié)pH至，定容至50ml，小濾器過(guò)濾。我做過(guò)G418殺傷曲線，300ug\ml. 加入有培養(yǎng)基的24孔板，將每孔中的G418濃度稀釋至0,,100,200,300,400,500,胞全部死亡濃度為基準(zhǔn)，一般400-８００左右，篩選時(shí)比該濃度再高一個(gè)級(jí)別，G418濃度太高也不好，會(huì)對(duì)細(xì)胞的損傷太大，影響增殖。Q:我用24孔板做了G418篩選的濃度梯度，確定最低致死濃度為600mg/l。還有，在多克隆形成后一定要及時(shí)凍存，以備后續(xù)試驗(yàn)。1，由于每種細(xì)胞對(duì)G418的敏感性不同，而且不同的廠家生產(chǎn)的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉劑中有效的G418含量大約為。2，G418是新霉素的類似物，兩者都是通過(guò)抑制核糖體的功能和蛋白質(zhì)的合成而殺死細(xì)胞的。
【正文】 變圓時(shí)，即用 10ul槍在顯微鏡下直接吸克隆，放入事先準(zhǔn)備好的加了培養(yǎng)基的 96 孔板內(nèi)，先吸大的克隆，在胰酶完全起到作用使細(xì)胞松散擴(kuò)散開(kāi) 了時(shí)，已經(jīng)吸了將近十個(gè)克隆了，動(dòng)作快一些時(shí)能吸十幾個(gè)克隆，我做過(guò)幾次了效果很好，沒(méi)有出現(xiàn)污染。（在要進(jìn)行操作時(shí)，用酒精將手好好擦擦，將顯微鏡用新潔爾滅也擦一下，一般不會(huì)有什么問(wèn)題），你可以試試，只要小心一些就行了。 5。關(guān)于穩(wěn)轉(zhuǎn)的方法，好像園子里很多 xdjm 都用的是有限稀釋法來(lái)作，但是我們實(shí)驗(yàn)室基本上都不用九十六孔做有限稀釋來(lái)作單克隆的，一般的做法都是這樣： 1。 皿鋪細(xì)胞，長(zhǎng)到大概 80％以上的時(shí)候作轉(zhuǎn)染。 2。轉(zhuǎn)染后一天消化，傳到一個(gè)大皿（ 1： 6）或者兩個(gè)大皿（ 1： 12）。 3。再過(guò)一天后 加入帶 G418 的培養(yǎng)基。 4。依據(jù)細(xì)胞不同，大概從加入 G418 的第三天到第八天之間細(xì)胞開(kāi)始出現(xiàn)大量死亡，活下來(lái)的細(xì)胞就形成單克隆。 5，單克隆長(zhǎng)到相對(duì)較大的集落后，于顯微鏡下用 200ul槍挑取細(xì)胞集落，一般挑上 48個(gè)，種在兩塊 24 孔板上。 6。于 24 孔板上繼續(xù)培養(yǎng)，約 5 天后即可消化傳代，取部分作收蛋白 western 之用，根據(jù) western 結(jié)果確定真陽(yáng)性。 我們基本上都是這樣 pick stable 的，除非一些對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)抑止作用強(qiáng)大或者 apoptosis 的inducer 之類的基因比較難挑到 stable 外， 一般還都能挑到 stable。當(dāng)然，轉(zhuǎn)染效率不能太低，超過(guò) 50％就相對(duì)比較容易了， 10％以上的可能最后形成的細(xì)胞集落就少，而且真陽(yáng)性也較少。對(duì)于那些轉(zhuǎn)染效率很低的細(xì)胞，我會(huì)連續(xù)轉(zhuǎn)染三次（中間如果細(xì)胞長(zhǎng)滿了就傳代），好像比較有效。 除非是類似帶 GFP 這樣能直接觀察到是否真陽(yáng)性的基因，我們才用有限稀釋法來(lái)作，要不好像也太麻煩了吧？耗時(shí)也多 單克隆化后細(xì)胞特點(diǎn)和處理： ：考慮質(zhì)粒的表達(dá)對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)有一定的影響，查文獻(xiàn)確認(rèn)一下。 ，再傳代時(shí)保證板子不影響細(xì) 胞貼壁，避免出現(xiàn)傳代后細(xì)胞浮起來(lái)后死亡的現(xiàn)象。 ，不加藥培養(yǎng) 2代，再加藥繼續(xù)篩選兩代，此時(shí)如果不出現(xiàn)死亡細(xì)胞則可以認(rèn)為是穩(wěn)定細(xì)胞系。復(fù)蘇后加 G418 傳代 2 次，然后按部就班。 ， G418 的濃度有人認(rèn)為需要比穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)小寫，此外，加藥后對(duì)蛋白質(zhì)的表達(dá)，細(xì)胞形態(tài)有影響，因此做功能時(shí)要停藥培養(yǎng)合適時(shí)間后再做。 PA317 細(xì)胞后再此篩選（需要隔一段時(shí)間再加壓篩一次），細(xì)胞也是死的厲害，不過(guò)還是可以篩到，不過(guò)需要用合適的濃度?？梢栽诩?xì)胞傳幾代后，分出一小部分，不加 G418培養(yǎng) 一段時(shí)間，然后再加你維持細(xì)胞的抗性的 G418濃度培養(yǎng)一天看細(xì)胞會(huì)不會(huì)死亡，如果死亡，說(shuō)明外源基因還沒(méi)有丟失。 ：轉(zhuǎn)染加藥一段時(shí)間后，板子上出現(xiàn)了幾個(gè)克隆，如果有幾十個(gè)克隆，然后挑其中七八個(gè)克隆到 24孔板里繼續(xù)加藥篩選，等 24 孔長(zhǎng)滿后再轉(zhuǎn)到 6 孔板繼續(xù)加藥篩選，6 孔板里長(zhǎng)差不多滿后，每孔消化下來(lái)大概一半做 WB鑒定目的基因表達(dá)，剩一半留著繼續(xù)加藥培養(yǎng)，等 WB 結(jié)果出來(lái)有陽(yáng)性的孔就保留下來(lái)，陰性的丟掉。 單克隆化后鑒定： ，通過(guò) PCR鑒定，發(fā)現(xiàn)目的基因并不上調(diào)，瞬時(shí)轉(zhuǎn)染表達(dá)是增高的。 原因：瞬轉(zhuǎn)是在強(qiáng)啟動(dòng)子下 ,穩(wěn)轉(zhuǎn)時(shí)你得到的 細(xì)胞株 可能失去了此啟動(dòng)子 ,或者是改變了細(xì)胞的生理特性 !用 WB 和瞬轉(zhuǎn)對(duì)照鑒定一下 ! 基因組 是隨機(jī)的，一般兩月后（傳代 10 代以上）還 表達(dá)你想要蛋白的單克隆可以認(rèn)為是整合了質(zhì)粒的。
環(huán)評(píng)公示相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號(hào)-1