【導(dǎo)讀】站自動與1100LC通訊，進(jìn)入的工作站畫面。菜單中的“ShowTopToolbar”，“Showstatustoolbar”，“Systemdiagram”,”Samplingdiagram”，使其命令前有“√”標(biāo)志，來調(diào)用所需的界面。On，單擊OK，則系統(tǒng)開始Purge，直到管線內(nèi)無氣泡為止,切換信道繼續(xù)Purge，直到所有要用信道無氣泡為止。Off，單擊Ok關(guān)泵，關(guān)閉Purgevalve。選中除“Dataanalysis”外的三項(xiàng)，單擊Ok，進(jìn)入下一畫面。,,也可Insert一行”Timetable”,編輯梯度。LimitsMax”處輸入柱子的最大耐高壓，以保護(hù)柱子。樣品后，會在洗瓶中洗針。的響應(yīng)時間,如>。收或低吸收區(qū)域。Peakwidth：其值盡可能接近要測的窄。同時可以輸入采集光譜。方式，步長，范圍，閾值。防樣品在池中沉淀?！癙eakwidth”---大多數(shù)分析設(shè)為4S，只有在高速分析下。讓流動相循環(huán)，節(jié)省流動相，檢測器連續(xù)運(yùn)行，可隨時投入使用。手動purge參比池，將其設(shè)。品峰被切平頭,則減少PMT值。

　　

【正文】 項(xiàng)可以忽略不計(jì)。γ是考慮到填料的存在使溶質(zhì)分子不能自由地軸向擴(kuò)散，而引入的柱參數(shù)，用以對 Dm 進(jìn)行校正。γ一般在 ~ 左右，毛細(xì)管柱的γ＝ 1。 3）傳質(zhì)阻抗（ mass transfer resistance）。由于溶質(zhì)分子在流動相、靜態(tài)流動相和固定相中的傳質(zhì) 過程而導(dǎo)致的峰展寬。溶質(zhì)分子在流動相和固定相中的擴(kuò)散、分配、轉(zhuǎn)移的過程并不是瞬間達(dá)到平衡，實(shí)際傳質(zhì)速度是有限的，這一時間上的滯后使色譜柱總是在非平衡狀態(tài)下工作，從而產(chǎn)生峰展寬。液相色譜的傳質(zhì)阻抗項(xiàng) Cu 又分為三項(xiàng)。 ①流動相傳質(zhì)阻抗 Hm＝ Cmd2pu/Dm， Cm 為常數(shù)。這是由于在一個流路中流路中心和邊緣的流速不等所致。靠近填充顆粒的流動相流速較慢，而中心較快，處于中心的分子還未來得及與固定相達(dá)到分配平衡就隨流動相前移，因而產(chǎn)生峰展寬。 ②靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗 Hsm＝ Csmd2pu/Dm， Csm 為 常數(shù)。這是由于溶質(zhì)分子進(jìn)入處于固定相孔穴內(nèi)的靜止流動相中，晚回到流路中而引起峰展寬。 Hsm 對峰展寬的影響在整個傳質(zhì)過程中起著主要作用。固定相的顆粒越小，微孔孔徑越大，傳質(zhì)阻力就越小，傳質(zhì)速率越高。所以改進(jìn)固定相結(jié)構(gòu)，減小靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻力，是提高液相色譜柱效的關(guān)鍵。 Hm 和 Hsm 都與固定相的粒徑平方 d2p 成正比，與擴(kuò)散系數(shù) Dm 成反比。因此應(yīng)采用低粒度固定相和低粘度流動相。高柱溫可以增大 Dm，但用有機(jī)溶劑作流動相時，易產(chǎn)生氣泡，因此一般采用室溫。 ③固定相傳質(zhì)阻抗 Hs＝ Csd2fu/Ds（液 液分配色譜）， Cs 為常數(shù)， df 為固定液的液膜厚度， Ds 為分子在固定液中的擴(kuò)散系數(shù)。在分配色譜中 Hs 與 df的平方成正比，在吸附色譜中 Hs 與吸附和解吸速度成反比。因此只有在厚涂層固定液、深孔離子交換樹脂或解吸速度慢的吸附色譜中， Hs 才有明顯影響。采用單分子層的化學(xué)鍵合固定相時 Hs 可以忽略。 從速率方程式可以看出，要獲得高效能的色譜分析，一般可采用以下措施：①進(jìn)樣時間要短。②填料粒度要小。③改善傳質(zhì)過程。過高的吸附作用力可導(dǎo)致嚴(yán)重的峰展寬和拖尾，甚至不可逆吸附。④適當(dāng)?shù)牧魉佟Ｒ?H 對 u作圖，則有一最佳線速度 uopt，在此線速度時， H 最小。一般在液相色譜中， uopt 很小（大約 ~），在這樣的線速度下分析樣品需要很長時間，一般來說都選在 1mm/s 的條件下操作。⑤較小的檢測器死體積。 3．柱外效應(yīng) 速率理論研究的是柱內(nèi)峰展寬因素，實(shí)際在柱外還存在引起峰展寬的因素，即柱外效應(yīng)（色譜峰在柱外死空間里的擴(kuò)展效應(yīng)）。色譜峰展寬的總方差等于各方差之和，即： σ 2＝σ 2柱內(nèi)＋σ 2 柱外＋σ 2其它柱外效應(yīng)主要由低劣的進(jìn)樣技術(shù)、從進(jìn)樣點(diǎn)到檢測池之間除柱子本身以外的所有死體積所引起。為了減少柱外效應(yīng) ，首先應(yīng)盡可能減少柱外死體積，如使用 零死體積接頭 連接各部件，管道對接宜呈流線形，檢測器的內(nèi)腔體積應(yīng)盡可能小。研究表明柱外死體積之和應(yīng)＜VR/。其次，希望將樣品直接進(jìn)在柱頭的中心部位，但是由于進(jìn)樣閥與柱間有接頭，柱外效應(yīng)總是存在的。此外，要求進(jìn)樣體積≤ VR/2。 柱外效應(yīng)的直觀標(biāo)志是容量因子 k小的組分（如 k＜ 2）峰形拖尾和峰寬增加得更為明顯； k 大的組分影響不顯著。由于 HPLC 的特殊條件，當(dāng)柱子本身 中國最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 21 頁 共 70 頁 效率越高（ N 越大），柱尺寸越小時，柱外效應(yīng)越顯得突出。而在經(jīng)典 LC 中則影響相對較小。 高壓液相色譜 HPLC 培訓(xùn)教程 (四 ) III． HPLC 系統(tǒng) HPLC 系統(tǒng)一般由輸液泵、進(jìn)樣器、色譜柱、檢測器、數(shù)據(jù)記錄及處理裝置等組成。其中輸液泵、色譜柱、檢測器是關(guān)鍵部件。有的儀器還有梯度洗脫裝置、在線脫氣機(jī)、自動進(jìn)樣器、預(yù)柱或保護(hù)柱、柱溫控制器等，現(xiàn)代 HPLC 儀還有微機(jī)控制系統(tǒng)，進(jìn)行自動化儀器控制和數(shù)據(jù)處理。制備型 HPLC 儀還備有自動餾分收集 裝置。 最早的液相色譜儀由粗糙的高壓泵、低效的柱、固定波長的檢測器、繪圖儀，繪出的峰是通過手工測量計(jì)算峰面積。后來的高壓泵精度很高并可編程進(jìn)行梯度洗脫，柱填料從單一品種發(fā)展至幾百種類型，檢測器從單波長至可變波長檢測器、可得三維色譜圖的二極管陣列檢測器、可確證物質(zhì)結(jié)構(gòu)的質(zhì)譜檢測器。數(shù)據(jù)處理不再用繪圖儀，逐漸取而代之的是最簡單的積分儀、計(jì)算機(jī)、工作站及網(wǎng)絡(luò)處理系統(tǒng)。 目前常見的 HPLC 儀生產(chǎn)廠家國外有 Waters 公司、 Agilent 公司（原 HP公司）、島津公司等，國內(nèi)有大連依利特公司、上海分析儀 器廠、北京分析儀器廠等。 一、輸液泵 1．泵的構(gòu)造和性能 輸液泵是 HPLC 系統(tǒng)中最重要的部件之一。泵的性能好壞直接影響到整個系統(tǒng)的質(zhì)量和分析結(jié)果的可靠性。輸液泵應(yīng)具備如下性能：①流量穩(wěn)定，其 RSD應(yīng)＜ %，這對定性定量的準(zhǔn)確性至關(guān)重要；②流量范圍寬，分析型應(yīng)在 ~10 ml/min 范圍內(nèi)連續(xù)可調(diào)，制備型應(yīng)能達(dá)到 100 ml/min；③輸出壓力高，一般應(yīng)能達(dá)到 150~300kg/cm2；④液缸容積?。虎菝芊庑阅芎茫透g。 泵的種類很多，按輸液性質(zhì)可分為恒壓泵和恒流泵。恒流泵按結(jié)構(gòu)又可分為螺旋注射泵、柱塞往復(fù)泵和隔膜往復(fù)泵。恒壓泵受柱阻影響，流量不穩(wěn)定；螺旋泵缸體太大，這兩種泵已被淘汰。目前應(yīng)用最多的是柱塞往復(fù)泵。 柱塞往復(fù)泵的液缸容積小，可至 ，因此易于清洗和更換流動相，特別適合于再循環(huán)和梯度洗脫；改變電機(jī)轉(zhuǎn)速能方便地調(diào)節(jié)流量，流量不受柱阻 中國最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 22 頁 共 70 頁 影響；泵壓可達(dá) 400kg/cm2。其主要缺點(diǎn)是輸出的脈沖性較大，現(xiàn)多采用雙泵系統(tǒng)來克服。雙泵按連接方式可分為并聯(lián)式和串聯(lián)式，一般說來并聯(lián)泵的流量重現(xiàn)性較好（ RSD 為 %左右，串聯(lián)泵為 ~%），但出故障的機(jī)會較多（因多一單 向閥），價格也較貴。 2．泵的使用和維護(hù)注意事項(xiàng) 為了延長泵的使用壽命和維持其輸液的穩(wěn)定性，必須按照下列注意事項(xiàng)進(jìn)行操作： ①防止任何固體微粒進(jìn)入泵體，因?yàn)閴m埃或其它任何雜質(zhì)微粒都會磨損柱塞、密封環(huán)、缸體和單向閥，因此應(yīng)預(yù)先除去流動相中的任何固體微粒。流動相最好在玻璃容器內(nèi)蒸餾，而常用的方法是濾過，可采用 Millipore 濾膜（ amp。micro。m 或 amp。micro。m）等濾器。泵的入口都應(yīng)連接砂濾棒（或片）。輸液泵的濾器應(yīng)經(jīng)常清洗或更換。 ②流動相不應(yīng)含有任何腐蝕性物質(zhì)，含有 緩沖液的流動相不應(yīng)保留在泵內(nèi)，尤其是在停泵過夜或更長時間的情況下。如果將含緩沖液的流動相留在泵內(nèi)，由于蒸發(fā)或泄漏，甚至只是由于溶液的靜置，就可能析出鹽的微細(xì)晶體，這些晶體將和上述固體微粒一樣損壞密封環(huán)和柱塞等。因此，必須泵入純水將泵充分清洗后，再換成適合于色譜柱保存和有利于泵維護(hù)的溶劑（對于反相鍵合硅膠固定相，可以是甲醇或甲醇 水）。 ③泵工作時要留心防止溶劑瓶內(nèi)的流動相被用完，否則空泵運(yùn)轉(zhuǎn)也會磨損柱塞、缸體或密封環(huán)，最終產(chǎn)生漏液。 ④輸液泵的工作壓力決不要超過規(guī)定的最高壓力，否則會使高壓密 封環(huán)變形，產(chǎn)生漏液。 ⑤流動相應(yīng)該先脫氣，以免在泵內(nèi)產(chǎn)生氣泡，影響流量的穩(wěn)定性，如果有大量氣泡，泵就無法正常工作。 如果輸液泵產(chǎn)生故障，須查明原因，采取相應(yīng)措施排除故障： ①沒有流動相流出，又無壓力指示。原因可能是泵內(nèi)有大量氣體，這時可打開泄壓閥，使泵在較大流量（如 5ml/min）下運(yùn)轉(zhuǎn)，將氣泡排盡，也可用一個 50ml 針筒在泵出口處幫助抽出氣體。另一個可能原因是密封環(huán)磨損，需更換。 ②壓力和流量不穩(wěn)。原因可能是氣泡，需要排除；或者是單向閥內(nèi)有異物，可卸下單向閥，浸入丙酮內(nèi)超聲清洗。有 時可能是砂濾棒內(nèi)有氣泡，或被鹽的微細(xì)晶?；蜃躺奈⑸锊糠侄氯?，這時，可卸下砂濾棒浸入流動相內(nèi)超聲除氣泡，或?qū)⑸盀V棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）內(nèi)迅速除去微生物，或?qū)Ⅺ}溶解，再立即清洗。 ③壓力過高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。壓力降低的原因則可能是管路有泄漏。檢查堵塞或泄漏時應(yīng)逐段進(jìn)行。 3．梯度洗脫 HPLC 有等強(qiáng)度 (isocratic)和梯度 (gradient)洗脫兩種方式。等度洗脫是在同一分析周期內(nèi)流動相組成保持恒定，適合于組分?jǐn)?shù)目較少，性質(zhì)差別不大的樣品。梯度洗脫是在一個分 析周期內(nèi)過程控制流動相的組成，如溶劑的極性、離子強(qiáng)度和 pH 值等，用于分析組分?jǐn)?shù)目多、性質(zhì)差異較大的復(fù)雜樣品。采用梯度洗脫可以縮短分析時間，提高分離度，改善峰形，提高檢測靈敏度，但是常常引起基線漂移和降低重現(xiàn)性。 梯度洗脫有兩種實(shí)現(xiàn)方式：低壓梯度（外梯度）和高壓梯度（內(nèi)梯度）。 中國最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 23 頁 共 70 頁 兩種溶劑組成的梯度洗脫可按任意程度混合，即有多種洗脫曲線：線性梯度、凹形梯度、凸形梯度和階梯形梯度。線性梯度最常用，尤其適合于在反相柱上進(jìn)行梯度洗脫。 在進(jìn)行梯度洗脫時，由于多種溶劑混合，而且組成不斷變化，因此 帶來一些特殊問題，必須充分重視： ①要注意溶劑的互溶性，不相混溶的溶劑不能用作梯度洗脫的流動相。有些溶劑在一定比例內(nèi)混溶，超出范圍后就不互溶，使用時更要引起注意。當(dāng)有機(jī)溶劑和緩沖液混合時，還可能析出鹽的晶體，尤其使用磷酸鹽時需特別小心。 ②梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，以保證良好的重現(xiàn)性。進(jìn)行樣品分析前必須進(jìn)行空白梯度洗脫，以辨認(rèn)溶劑雜質(zhì)峰，因?yàn)槿跞軇┲械碾s質(zhì)富集在色譜柱頭后會被強(qiáng)溶劑洗脫下來。用于梯度洗脫的溶劑需徹底脫氣，以防止混合時產(chǎn)生氣泡。 ③混合溶劑的粘度常隨組成而變化，因 而在梯度洗脫時常出現(xiàn)壓力的變化。例如甲醇和水粘度都較小，當(dāng)二者以相近比例混合時粘度增大很多，此時的柱壓大約是甲醇或水為流動相時的兩倍。因此要注意防止梯度洗脫過程中壓力超過輸液泵或色譜柱能承受的最大壓力。 ④每次梯度洗脫之后必須對色譜柱進(jìn)行再生處理，使其恢復(fù)到初始狀態(tài)。需讓 10~30 倍柱容積的初始流動相流經(jīng)色譜柱，使固定相與初始流動相達(dá)到完全平衡。 二、進(jìn)樣器 早期使用隔膜和停流進(jìn)樣器，裝在色譜柱入口處?，F(xiàn)在大都使用六通進(jìn)樣閥或自動進(jìn)樣器。進(jìn)樣裝置要求：密封性好，死體積小，重復(fù)性好，保證中心進(jìn) 樣，進(jìn)樣時對色譜系統(tǒng)的壓力、流量影響小。 HPLC 進(jìn)樣方式可分為：隔膜進(jìn)樣、停流進(jìn)樣、閥進(jìn)樣、自動進(jìn)樣。 1．隔膜進(jìn)樣。用微量注射器將樣品注入專門設(shè)計(jì)的與色譜柱相連的進(jìn)樣頭內(nèi)，可把樣品直接送到柱頭填充床的中心，死體積幾乎等于零，可以獲得最佳的柱效，且價格便宜，操作方便。但不能在高壓下使用（如 10MPa 以上）；此外隔膜容易吸附樣品產(chǎn)生記憶效應(yīng)，使進(jìn)樣重復(fù)性只能達(dá)到 1~2%；加之能耐各種溶劑的橡皮不易找到，常規(guī)分析使用受到限制。 2．停流進(jìn)樣?？杀苊庠诟邏合逻M(jìn)樣。但在 HPLC 中由于隔膜的污染，停泵或重新啟動時往往 會出現(xiàn) 鬼峰 ；另一缺點(diǎn)是保留時間不準(zhǔn)。在以峰的始末信號控制餾分收集的制備色譜中，效果較好。 3．閥進(jìn)樣。一般 HPLC 分析常用六通進(jìn)樣閥（以美國 Rheodyne 公司的 7725 和7725i 型最常見），其關(guān)鍵部件由圓形密封墊（轉(zhuǎn)子）和固定底座（定子）組成。由于閥接頭和連接管死體積的存在，柱效率低于隔膜進(jìn)樣（約下降 5~10%左右），但耐高壓（ 35~40MPa），進(jìn)樣量準(zhǔn)確，重復(fù)性好（ %），操作方便。 六通閥的進(jìn)樣方式有部分裝液法和完全裝液法兩種。①用部分裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量應(yīng)不大于定量環(huán)體積的 50%（最多 75％），并要求每次進(jìn)樣體積準(zhǔn)確、相同。此法進(jìn)樣的準(zhǔn)確度和重復(fù)性決定于注射器取樣的熟練程度，而且易產(chǎn)生由進(jìn)樣引起的峰展寬。②用完全裝液法進(jìn)樣時，進(jìn)樣量應(yīng)不小于定量環(huán)體積的5~10 倍（最少 3 倍），這樣才能完全置換定量環(huán)內(nèi)的流動相，消除管壁效應(yīng)，確保進(jìn)樣的準(zhǔn)確度及重復(fù)性。 六通閥使用和維護(hù)注意事項(xiàng)：①樣品溶液進(jìn)樣前必須用 amp。micro。m濾膜過濾，以減少微粒對進(jìn)樣閥的磨損。②轉(zhuǎn)動閥芯時不能太慢，更不能停留在 中國最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 24 頁 共 70 頁 中間位置，否則流動相受阻，使泵內(nèi)壓力劇增，甚至超過泵的最大壓力；再轉(zhuǎn)到進(jìn)樣位時，過高的 壓力將使柱頭損壞。③為防止緩沖鹽和樣品殘留在進(jìn)樣閥中，每次分析結(jié)束后應(yīng)沖洗進(jìn)樣閥。通?？捎盟疀_洗，或先用能溶解樣品的溶劑沖洗，再用水沖洗。 4．自動進(jìn)樣。用于大量樣品的常規(guī)分析。 三、色譜柱 色譜是一種分離分析手段，分離是核心，因此擔(dān)負(fù)分離作用的色譜柱是色譜系統(tǒng)的心臟。對色譜柱的要求是柱效高、選擇性好，分析速度快等。市售的用于 HPLC 的各種微粒填料如多孔硅膠以及以硅膠為基質(zhì)的鍵合相、氧化鋁、有機(jī)聚合物微球（包括離子交換樹脂）、多孔碳等，其粒度一般為 3,5,7,10μ m等，柱效理論值可達(dá) 5~16 萬 /米 。對于一般的分析只需 5000 塔板數(shù)的柱效；對于同系物分析，只要 500 即可；對于較難分離物質(zhì)對則可采用高達(dá) 2 萬的