【文章內(nèi)容簡(jiǎn)介】 管連接，中間也放置壓環(huán)用于柱接頭的密封。為了盡量減少柱外死體積，在安裝色譜柱時(shí)，用Φ 連接管通過(guò)空心螺釘壓環(huán)后要盡量插到底，然后再擰緊空心螺釘。壓環(huán)被空心螺釘擠壓變形后緊箍在連接管上 (連接管通過(guò)壓環(huán)后露出的管長(zhǎng)度應(yīng)嚴(yán)格控制在 2． 5mm 長(zhǎng)或其它固定尺寸 )。 在兩端柱接頭內(nèi)，柱管兩端各放置一片不銹鋼濾片 (或?yàn)V網(wǎng) )，用于封堵柱填料不被流動(dòng)相沖出柱外而流失?？罩鹘M件均為 316不銹鋼材質(zhì)，能耐受一般的溶劑作用。但由于含氯化物的溶劑對(duì)其有一定的腐蝕性，故使用時(shí)要注意，柱及連接管內(nèi)不能長(zhǎng)時(shí)間存留此類(lèi)溶劑，以避免腐蝕。 b、柱填料： 液相色譜柱的分離作用是在填料與流動(dòng)相之間進(jìn)行的，柱子的分類(lèi)是依據(jù)填料類(lèi)型而定。 正相柱：多以硅膠為柱填料。根據(jù)外型可分為無(wú)定型和球型兩種， 其顆粒直徑在 3— 10 μ m的范圍內(nèi)。另一類(lèi)正相填料是硅膠表面鍵合 — CN， NH2 等官能團(tuán)即所謂的鍵合相硅膠。 反相柱：主要是以硅膠為基質(zhì)，在其表面鍵合十八烷基官能團(tuán) (ODS)的非極性填料。也有無(wú)定型和球型之分。 常用的其它的反相填料還有鍵合 C C C苯基等，其顆粒粒徑在 3—10 μ m 之間。 2，色譜柱的安裝： a、拆開(kāi)柱包裝盒，確認(rèn)色譜柱的類(lèi)型、尺寸、出廠日期以及柱內(nèi)貯存的溶劑。 b、擰下柱兩端接頭的密封堵頭放回包裝盒供備用。 c、 按柱管上標(biāo)示的流動(dòng)相流向，將色 譜柱的入口端通過(guò)連接管與進(jìn)樣閥出口相連接 (如條件允許，建議在柱前使用保護(hù)柱 )；柱的出口與檢測(cè)器連接。連接管是外徑為 、內(nèi)徑為 的不銹鋼管。連接管的兩端均有空心螺釘及密封用壓環(huán)。在接管時(shí)一定要設(shè)法降低柱外死體積。連接管通過(guò)空心螺釘、壓環(huán)后盡量用力插到底，然后順時(shí)針擰緊空心螺釘，直到擰不動(dòng)為止，再用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰 1／ 41／ 2 圈，切記不要用力過(guò)大。如色譜柱通過(guò)流動(dòng)相加壓后有漏液現(xiàn)象，請(qǐng)用扳手繼續(xù)順時(shí)針擰 1／ 4圈，直至不漏液為止。 二、液相色譜柱的使用： 色譜柱在使用前，最好進(jìn)行 柱的性能測(cè)試，并將結(jié)果保存起來(lái)，作為今后評(píng)價(jià)柱性能變化的參考。但要注意：柱性能可能由于所使用的樣品、流動(dòng)相、柱溫等條件的差異而有所不同；另外，在做柱性能測(cè)試時(shí)是按照色譜柱出廠報(bào)告中的條件進(jìn)行 (出廠測(cè)試所使用的條件是最佳條件 )，只有這樣，測(cè)得的結(jié)果才有可比性。 樣品的前處理： a、最好使用流動(dòng)相溶解樣品。 b、使用予處理柱除去樣品中的強(qiáng)極性或與柱填料產(chǎn)生不可逆吸附的雜質(zhì)。 c、使用 m 的過(guò)濾膜過(guò)濾除去微粒雜質(zhì)。 流動(dòng)相的配制： 液相色譜是樣品組分在柱填料與流 動(dòng)相之間質(zhì)量交換而達(dá)到分離的目的，因此要求流動(dòng)相具備以下的特點(diǎn)： 中國(guó)最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 12 頁(yè) 共 70 頁(yè) a、流動(dòng)相對(duì)樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會(huì)沉淀在柱中 (或長(zhǎng)時(shí)間保留在柱中 )。 b、流動(dòng)相具有一定惰性，與樣品不產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng) (特殊情況除外 )。 c、流動(dòng)相的黏度要盡量小，以便在使用較長(zhǎng)的分析柱時(shí)能得到好的分離效果；同時(shí)降低柱壓降，延長(zhǎng)液體泵的使用壽命 (可運(yùn)用提高溫度的方法降低流動(dòng)相的黏度 )。 d、流動(dòng)相的物化性質(zhì)要與使用的檢測(cè)器相適應(yīng)。如使用 UV檢測(cè)器，最好使用對(duì)紫外吸收較低的溶劑配制。 e、流動(dòng)相沸點(diǎn)不 要太低，否則容易產(chǎn)生氣泡，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)無(wú)法進(jìn)行。 f、在流動(dòng)相配制好后，一定要進(jìn)行脫氣。除去溶解在流動(dòng)相中的微量氣體既有利于檢測(cè)，還可以防止流動(dòng)相中的微量氧與樣品發(fā)生作用。 流動(dòng)相流速的選擇： 因柱效是柱中流動(dòng)相線性流速的函數(shù)，使用不同的流速可得到不同的柱效。對(duì)于一根特定的色譜柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。對(duì)內(nèi)徑為 的色譜柱，流速一般選擇 1ml／ min，對(duì)于內(nèi)徑為 柱，流速 ／ min 為佳。 當(dāng)選用最佳流速時(shí)，分析時(shí)間可能延長(zhǎng)?？刹捎酶淖兞鲃?dòng)相的洗滌強(qiáng)度 的方法以縮短分析時(shí)間 (如使用反相柱時(shí)，可適當(dāng)增加甲醇或乙腈的含量 )。 注意： a．由于甲醇廉價(jià)，對(duì)于反相柱推薦使用甲醇體系 (必須使用乙腈的場(chǎng)合除外 )。 b．對(duì)于正相柱推薦使用沸程為 3060℃的石油醚或提純后的己烷作流動(dòng)相，沒(méi)有提純的己烷不得使用。用水最好使用超純水 (電阻率大于 18 兆歐 )，去離子水及雙蒸水中含有酚類(lèi)雜質(zhì)，有可能影響分析結(jié)果。 c．含水流動(dòng)相最奸在實(shí)驗(yàn)前配制，尤其是夏天使用緩沖溶液作為流動(dòng)相不要過(guò)夜。最好加入迭氮化鈉，防止細(xì)菌生長(zhǎng)。 d．流動(dòng)相要求使用 μ m 濾膜過(guò)濾，除去微粒雜質(zhì)。 e．使用 HPLC 級(jí)溶劑配制流動(dòng)相，使用合適的流動(dòng)相可延長(zhǎng)色譜柱的使用壽命，提高柱性能。 柱性能測(cè)試： 啟動(dòng)液相色譜儀： a、流動(dòng)相流速設(shè)定為 1ml／ min。 b、 UV 檢測(cè)器波長(zhǎng)設(shè)定為 254nm。 使用出廠測(cè)試時(shí)使用的流動(dòng)相組成及測(cè)試樣品。 記錄并計(jì)算測(cè)試結(jié)果。 *參考 (標(biāo)準(zhǔn) JB522691)液相色譜儀測(cè)試用標(biāo)準(zhǔn)色譜柱。 中國(guó)最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 13 頁(yè) 共 70 頁(yè) 高壓液相色譜 HPLC培訓(xùn)教程 (一 ) I．概論 一、液相色譜理論發(fā)展簡(jiǎn)況 色譜法的分離原理是：溶于流動(dòng)相 (mobile phase)中的各組分經(jīng)過(guò)固定相時(shí)，由于與固定相 (stationary phase)發(fā)生作用（吸附、分配、離子吸引、排阻、親和）的大小、強(qiáng)弱不同，在固定相中滯留時(shí)間不同，從而先后從固定相中流出。又稱(chēng)為色層法、層析法。 色譜法最早是由俄國(guó)植物學(xué)家茨維特（ Tswett）在 1906 年研究用碳 酸鈣分離植物色素時(shí)發(fā)現(xiàn)的，色譜法 (Chromatography)因之得名。后來(lái)在此基礎(chǔ)上發(fā)展出紙色譜法、薄層色譜法、氣相色譜法、液相色譜法。 液相色譜法開(kāi)始階段是用大直徑的玻璃管柱在室溫和常壓下用液位差輸送流動(dòng)相，稱(chēng)為經(jīng)典液相色譜法，此方法柱效低、時(shí)間長(zhǎng)（常有幾個(gè)小時(shí)）。高效液相色譜法 (High performance Liquid Chromatography， HPLC)是在經(jīng)典液相色譜法的基礎(chǔ)上，于 60 年代后期引入了氣相色譜理論而迅速發(fā)展起來(lái)的。它與經(jīng)典液相色譜法的區(qū)別是填料顆粒小而均勻，小顆粒 具有高柱效，但會(huì)引起高阻力，需用高壓輸送流動(dòng)相，故又稱(chēng)高壓液相色譜法 (High Pressure Liquid Chromatography， HPLC)。又因分析速度快而稱(chēng)為高速液相色譜法 (High Speed Liquid Chromatography， HSLP)。也稱(chēng)現(xiàn)代液相色譜。 二、 HPLC 的特點(diǎn)和優(yōu)點(diǎn) HPLC 有以下特點(diǎn)： 高壓 壓力可達(dá) 150~300Kg/cm2。色譜柱每米降壓為 75 Kg/cm2 以上。 高速 流速為 ~ ml/min。 高效 可達(dá) 5000 塔板每米。在一根柱中同時(shí)分離 成份可達(dá) 100 種。 高靈敏度 紫外檢測(cè)器靈敏度可達(dá) 。同時(shí)消耗樣品少。 HPLC 與經(jīng)典液相色譜相比有以下優(yōu)點(diǎn)： 速度快 通常分析一個(gè)樣品在 15~30 min，有些樣品甚至在 5 min 內(nèi)即可完成。 分辨率高 可選擇固定相和流動(dòng)相以達(dá)到最佳分離效果。 靈敏度高 紫外檢測(cè)器可達(dá) ，熒光和電化學(xué)檢測(cè)器可達(dá) 。 柱子可反復(fù)使用 用一根色譜柱可分離不同的化合物。 樣品量少，容易回收 樣品經(jīng)過(guò)色譜柱后不被破壞，可以收集單一組分或做制備。 中國(guó)最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 14 頁(yè) 共 70 頁(yè) 三、色譜法分類(lèi) 按兩相的物理狀態(tài)可分為：氣相色譜 法 (GC)和液相色譜法 (LC)。氣相色譜法適用于分離揮發(fā)性化合物。 GC 根據(jù)固定相不同又可分為氣固色譜法 (GSC)和氣液色譜法 (GLC)，其中以 GLC 應(yīng)用最廣。液相色譜法適用于分離低揮發(fā)性或非揮發(fā)性、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)。 LC 同樣可分為液固色譜法 (LSC)和液液色譜法(LLC)。此外還有超臨界流體色譜法 (SFC)，它以超臨界流體（界于氣體和液體之間的一種物相）為流動(dòng)相（常用 CO2），因其擴(kuò)散系數(shù)大，能很快達(dá)到平衡，故分析時(shí)間短，特別適用于手性化合物的拆分。 按原理分為吸附色譜法 (AC)、分配色譜法 (DC)、離子交換色譜法 (IEC)、排阻色譜法 (EC，又稱(chēng)分子篩、凝膠過(guò)濾 (GFC)、凝膠滲透色譜法 (GPC）和親和色譜法 ,此外還有電泳。按操作形式可分為紙色譜法 (PC)、薄層色譜法 (TLC)、柱色譜法。 四、色譜分離原理 高效液相色譜法按分離機(jī)制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對(duì)色譜法及分 子排阻色譜法。 1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據(jù)固定相對(duì)組分吸附力大小不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)吸附－解吸附的平衡過(guò)程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度 5~10μ m。適用于分離分子量 200~1000 的組分，大多數(shù)用于非離子型化合物，離子型化合物易產(chǎn)生拖尾。常用于分離同分異構(gòu)體。 2．液液色譜法 使用將特定的液態(tài)物質(zhì)涂于擔(dān)體表面，或化學(xué)鍵合于擔(dān)體表面而形成的固定相，分離原理是根據(jù)被分離的組分在流動(dòng)相和固定相中溶解度不同而分離。分離過(guò)程是一個(gè)分配平衡過(guò)程。 涂布式固定相應(yīng)具有良好的惰性；流動(dòng)相必須預(yù)先用固定相飽和，以減少固定相從擔(dān)體表面流失；溫度的變化和不同批號(hào)流動(dòng)相的區(qū)別常引起柱子的變化；另外在流動(dòng)相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復(fù)雜化。由于涂布式固定相很難避免固定液流失，現(xiàn)在已很少采用?，F(xiàn)在多采用的是化學(xué)鍵合固定相，如 C1 C氨基柱、氰基柱和苯基柱。 中國(guó)最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理 . 部分版權(quán)歸原作者所有 ) 第 15 頁(yè) 共 70 頁(yè) 液液色譜法按固定相和流動(dòng)相的極性不同可分為正相色譜法 (NPC)和反相色譜法 (RPC)。 正相色譜法 采用極性固定相 (如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相 )；流動(dòng)相為相對(duì)非極性的疏水性溶劑 (烷烴類(lèi)如正已烷、環(huán)已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調(diào)節(jié)組分的保留時(shí)間。常用于分離中等極性和極性較強(qiáng)的化合物(如酚類(lèi)、胺類(lèi)、羰基類(lèi)及氨基酸類(lèi)等）。 反相色譜法 一般用非極性固定相（如 C1 C8）；流動(dòng)相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機(jī)溶劑以調(diào)節(jié)保留時(shí)間。適用于分離非極性和極性較弱的化合物。 RPC 在現(xiàn)代液相色譜中應(yīng)用最為廣泛，據(jù)統(tǒng)計(jì)，它占整個(gè) HPLC 應(yīng)用的 80%左右。 隨著柱填料的快速發(fā)展，反相色譜法的應(yīng)用范圍逐 漸擴(kuò)大，現(xiàn)已應(yīng)用于某些無(wú)機(jī)樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過(guò)程的解離，常用緩沖液控制流動(dòng)相的 pH 值。但需要注意的是， C18 和 C8使用的 pH 值通常為 ~（ 2~8），太高的 pH 值會(huì)使硅膠溶解，太低的 pH 值會(huì)使鍵合的烷基脫落。有報(bào)告新商品柱可在 pH ~10 范圍操作。 正相色譜法與反相色譜法比較表 正相色譜法 反相色譜法 固定相極性 高～中 中～低 流動(dòng)相極性 低～中 中～高 組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出 從上表可看出，當(dāng)極性為中等時(shí)正相色譜法與反相色譜法沒(méi)有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。 3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹(shù)脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯(lián)形成的聚合物骨架，在表面未端芳環(huán)上接上羧基、磺酸基（稱(chēng)陽(yáng)離子交換樹(shù)脂）或季氨基（陰離子交換樹(shù) 脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹(shù)脂上可電離離子與流動(dòng)相中具有相同電荷的離子及被測(cè)組分的離子進(jìn)行可逆交換，根據(jù)各離子與離子交換基團(tuán)具有不同的電荷吸引力而分離。 緩沖液常用作離子交換色譜的流動(dòng)相。被分離組分在離子交換柱中的保留時(shí)間除跟組分離子與樹(shù)脂上的離子交換基團(tuán)作用強(qiáng)弱有關(guān)外，它還受流動(dòng)相的pH值和離子強(qiáng)度影響。 pH 值可改變化合物的解離程度，進(jìn)而影響其與固定相的作用。流動(dòng)相的鹽濃度大，則離子強(qiáng)度高，不利于樣品的解離，導(dǎo)致樣品較快流出。 離子交換色譜法主要用于分析有機(jī)酸、氨基酸、多肽及核酸。 4． 離子對(duì)色譜法 又稱(chēng)偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據(jù)被測(cè)組分離子與離子對(duì)試劑離子形成中性的離子對(duì)化合物后，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用于分析離子強(qiáng)度大的酸堿物質(zhì)。 中國(guó)最大的管理資料下載 中心 (收集 \整理