【文章內(nèi)容簡介】 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 7 將細(xì)胞凍結(jié)，并保持細(xì)胞完整，然后 在真空中使水分升華致干。在此環(huán)境中，微生物的生長和代謝都暫時停止，不易發(fā)生變異，故可長時間保存，一般為5～ 10 年，最多可達(dá) 15 年之久。此法兼?zhèn)淞? 低溫、干燥及缺氧幾方面條件，使微生物可以保存較長時間，但過程較麻煩，需要一定的設(shè)備。 孢子的制備 這是發(fā)酵工序的開端，是一個重要環(huán)節(jié)?？股禺a(chǎn)量和成品質(zhì)量同菌種性能以及同孢子和種子的情況有密切關(guān)系。生產(chǎn)用的孢子需 經(jīng)過純種和生產(chǎn)能力的檢驗，符合規(guī)定的才能用來制備種子。 保藏在砂土管或冷凍干燥管仲的菌種經(jīng)無菌手續(xù)接入適合于孢子發(fā)芽或菌絲生長的斜面培養(yǎng)基中，經(jīng)培養(yǎng)成熟后挑選菌落正常的孢子可再一次接入試管斜面。對于產(chǎn)孢子能力強的及孢子發(fā)芽、生長繁殖快的菌種可以采用固體培養(yǎng)基孢子，孢子可直接作為中子罐的種子。 種子制備 種子制備是指孢子接入種子罐后，在罐中繁殖成大量菌絲的過程 ，其 目的是使孢子發(fā)芽、繁殖和獲得足夠數(shù)量的菌絲，以便接種到發(fā)酵罐當(dāng)中去。種子制備所使用的培養(yǎng)基及其它工藝條件，都要有利于孢子發(fā)芽和菌絲繁殖。 種子 罐級數(shù)是在指制備種子需逐級擴大培養(yǎng)的次數(shù)，一般根據(jù)種子的生長特性、孢子發(fā)芽及菌體繁殖速度，以及發(fā)酵罐的容積而定。青霉素種子制備一般為二級種子罐擴大培養(yǎng)。 發(fā)酵培養(yǎng)基 介紹 培養(yǎng)基是供微生物生長繁殖和合成各種代謝產(chǎn)物所需要的按一定比例配制的多種營養(yǎng)物質(zhì)的混合物。培養(yǎng)基的組成和比例是否恰當(dāng)，直接影響微生物的生長、生產(chǎn)和工藝選擇、產(chǎn)品質(zhì)量和產(chǎn)量等。青霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源、無機鹽及金屬離子、添加前體、消沫劑五部分組成。 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 8 碳源的主要作用是：為微生物菌種的生長繁殖提供能源和合成菌體所必需的碳成分；為合成目 的產(chǎn)物提供所需的碳成分。青霉素發(fā)酵中常用乳酸或葡萄糖，也可采用葡萄糖母液、糖蜜等。其中乳糖最為便宜，但因貨源較少，很多國家采用葡萄糖代替。但當(dāng)葡萄糖濃度超過一定限度時，會過分加速菌體的呼吸，以至培養(yǎng)基中的溶解氧不能滿足需要，使一些中間代謝物不能完全氧化而積累在菌體或培養(yǎng)基中，導(dǎo)致 pH 下降，影響某些酶的活性，從而抑制微生物的生長河產(chǎn)物的合成。 氮源的作用是供應(yīng)菌體合成氨基酸和三肽的原料，以進(jìn)一步合成青霉素。主要有機氮源為玉米漿、棉籽餅粉、花生餅粉、酵母粉、蛋白胨等。玉米漿為較理想的氮源，含固體量少，有利于通氣 及氧的傳遞，因而利用率較高。固體有機氮源原料一般需粉碎至 200 目以下的細(xì)度。有機氮源還可以提供一部分有機磷，供菌體生長。無機氮如硝酸鹽、尿素、硫酸銨等可適量使用。 碳酸鈣用來中和發(fā)酵過程中產(chǎn)生的雜酸，并控制發(fā)酵液的 pH 值，為菌體提供營養(yǎng)的無機磷源一般采用磷酸二氫鉀。另外加入硫代硫酸鈉或硫酸鈉以提供青霉素分子中所需的硫。由于現(xiàn)在還有一些工廠采用鐵罐發(fā)酵，在發(fā)酵過程中鐵離子便逐漸進(jìn)入發(fā)酵液。發(fā)酵時間愈長，則鐵離子愈多。鐵離子在 50181。g/ml 以上便會影響青霉素的合成。采用鐵絡(luò)合劑以抑制鐵離子的影響，但實際對青霉素 產(chǎn)量并無改進(jìn)。所以青霉素的發(fā)酵罐采用不銹鋼制造為宜，其他重金屬離子如銅、汞、鋅等能催化青霉素的分解反應(yīng)。 添加苯乙酸或者苯乙酰胺，可以借?；D(zhuǎn)移的作用，將苯乙酸轉(zhuǎn)入青霉素分子，提高青霉素 G 的生產(chǎn)強度，添加苯氧乙酸則產(chǎn)生青霉素 V。因此前體的加入成為青霉素發(fā)酵的關(guān)鍵問題之一。但苯乙酸對發(fā)酵有影響，一般以苯乙酰胺較好。也有人采用苯乙酸月桂醇酯，其優(yōu)點是在發(fā)酵中月桂醇酯水解，苯乙酸結(jié)合進(jìn)青霉素成品。而月桂酸作為細(xì)菌營養(yǎng)劑及發(fā)酵液消沫劑，且其毒性比苯乙酸小，但價格較貴。前體要在發(fā)酵開始 20h 后加入，并在整個發(fā)酵過程中 控制在 50181。g/ml 左右 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 9 由于在發(fā)酵過程中二氧化碳的不斷產(chǎn)生，加上培養(yǎng)基中有很多有機氮源含有蛋白質(zhì)，因此在發(fā)酵罐內(nèi)會產(chǎn)生大量泡沫，如不嚴(yán)加控制，就會產(chǎn)生發(fā)酵液逃液，導(dǎo)致染菌的后果。采用植物油消沫仍舊是個好方法，一方面作為消沫劑，另一方面還可以起到碳源作用，但現(xiàn)在已普遍采用合成消沫劑（如聚酯、聚醇類消沫劑）代替豆油。 滅菌 “滅菌”指的是用化學(xué)或物理的方法殺滅或除去物料及設(shè)備中所有的有生命物質(zhì)的技術(shù)或工藝流程。 滅菌實質(zhì)上可分殺菌和溶菌兩種，前者指菌體雖死，但形體尚存，后者則指菌體殺死后，其細(xì)胞發(fā)生溶 化、消失的現(xiàn)象。 工業(yè)上常用的方法有：干熱滅菌、濕熱滅菌、化學(xué)藥劑滅菌、射線滅菌和介質(zhì)過濾除菌等幾種。 在青霉素的生產(chǎn)中，對培養(yǎng)基和發(fā)酵罐主要采用的是濕熱蒸汽滅菌和空氣過濾除菌的方法。 發(fā)酵 這一過程的目的主要是為了使微生物分泌大量的抗生素。發(fā)酵開始前，有關(guān)設(shè)備和培養(yǎng)基必須先經(jīng)過滅菌，后接入種子。接種量一般為 5～ 20%。發(fā)酵周期一般為 4～ 5 天，但也有少于 24 小時，或長達(dá)二周以上的。在整個過程中，需要不斷通氣和攪拌，維持一定的罐溫和罐壓，并隔一段時間取樣進(jìn)行生化分析和無菌試驗，觀察代謝變化、抗生素產(chǎn)生 情況和有無雜菌污染。 發(fā)酵的過程控制 碳源控制 ： 青霉菌能利用多種碳源，如乳糖、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖、甘露糖、淀粉和天然油脂等。乳糖是青霉素生物合成的最好碳源，葡萄青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 10 糖也是比較好的碳源，但必須控制其加入的濃度，因為葡萄糖易被菌體氧化并產(chǎn)生抑制抗生素合成酶形成的物質(zhì)，從而影響青霉素的合成，所以可以采用連續(xù)添加葡萄糖的方法代替乳糖。 苯乙酸或其衍生物苯乙酰胺、苯乙胺、苯乙酰甘氨酸等均可作為青霉素G 的側(cè)鏈前體。菌體對前體的利用有兩個途徑：直接結(jié)合到產(chǎn)物分子中或作為養(yǎng)料和能源利用，即氧化為二氧化碳和水。 前體究竟通過哪個途徑被菌體利用，主要取決于培養(yǎng)條件以及所用菌種的特性。 通過比較苯乙酰胺、苯乙酸及苯氧基乙酸的毒性，除苯氧基乙酸外，苯乙酰胺和苯乙酸的毒性取決于培養(yǎng)基的 pH 和前體的濃度。堿性時，苯乙酰胺有毒；酸性時，苯乙酸毒性較大；中性時，苯乙酰胺的毒性大于苯乙酸。前體用量大于 %時，青霉素的生物合成均下降。所以一般發(fā)酵液中前體濃度以始終維持在 %為宜。 在堿性條件下，苯乙酸被菌體氧化的速率隨培養(yǎng)基 pH 上升而增加。年幼的菌絲不氧化前體，而僅利用它來構(gòu)成青霉素分子。隨著菌齡的增大，氧化能力逐漸增加。培 養(yǎng)基成分對前體的氧化程度有較大影響，合成培養(yǎng)基比復(fù)合培養(yǎng)基對前體的氧化量少。 為了盡量減少苯乙酸的氧化，生產(chǎn)上多用間歇或連續(xù)添加低濃度苯乙酸的方法，以保持前體的供應(yīng)速率略大于生物合成的需要。 pH 控制 ： 在青霉素發(fā)酵過程中， pH 是通過下列手段控制的：如 pH過高，則添加糖、硫酸或無機氮源；若 pH 過低，則加入碳酸鈣、氫氧化鈉、氨或尿素，也可提高通氣量。另外，也可利用自動加入酸或堿的方法，使發(fā)酵液 pH 維持在 ～ ，以提高青霉素產(chǎn)量。 溫度控制 ： 青霉菌生長的適宜溫度為 30℃，而分泌青霉素的適宜溫度是 20℃左右，因此生產(chǎn)上采用變溫控制的方法，使之適合不同階段的需要。一般一級種子的培養(yǎng)溫度控制在 27177。 1℃左右；二級種子的培養(yǎng)溫度控制在青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 11 25177。 1℃左右；發(fā)酵前期和中期的溫度控制在 26℃左右；發(fā)酵后期的溫度控制在 24℃左右。 補料控制 ： 發(fā)酵過程中除以中間補糖控制糖濃度及 pH 外，補加氮源也可提高發(fā)酵單位。經(jīng)試驗證實：若在發(fā)酵 60～ 70h 開始分次補加硫酸銨，則在 90h 后菌絲含氮量幾乎不下降，維持在 6%～ 7%，且 60%～ 70%的菌絲處于年幼階段，菌絲呼吸強 度維持在二氧化碳量近 30μ l/（ mg 菌絲 h），抗生素產(chǎn)率為最高水平的 30%～ 40%；而不加硫酸銨的對照罐，在發(fā)酵中期菌絲含氮量為 7%，以后逐級下降。至發(fā)酵結(jié)束時為 4%。發(fā)酵結(jié)束時呼吸強度降至二氧化碳量為 16μ l/（ mg 菌絲 h），且抗生素產(chǎn)量下降至零，總產(chǎn)量僅為試驗罐的 1/2。因此，為了延長發(fā)酵周期，提高青霉素產(chǎn)量，發(fā)酵過程分次補加氮源也是有效的措施。 鐵離子的影響 ： 三價鐵離子對青霉素生物合成有顯著影響，一般若發(fā)酵液中鐵離子含量超過 30～ 40μ g/ml，則發(fā)酵單位增長緩慢。鐵離子對產(chǎn)黃青霉綠色孢子合成 青霉素的影響見下表。因此鐵罐在使用前必須進(jìn)行處理，可在罐壁涂上環(huán)氧樹脂等保護(hù)層，使鐵離子含量控制在 30μ g/ml 以下。 防止染菌的要點 染菌是抗生素發(fā)酵的大敵，不制服染菌就不能實現(xiàn)優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。影響染菌的因素很多，而且?guī)щS機性質(zhì)，但只要認(rèn)真對待，過細(xì)地工作，染菌是可以防止的。請到左邊的導(dǎo)航欄里選擇查看防止染菌的要點的內(nèi)容。 空氣系統(tǒng)的要求 防止空氣帶菌主要是提高空壓機進(jìn)口空氣的潔凈度，防止空氣夾帶油和水及空氣過濾器失效。 提高空壓機進(jìn)口空氣的潔凈度，可以從提高吸氣口的位置及加強空氣 的壓縮前過濾著手。防止空氣夾帶油、水，除加強去除油、水的措施外，還必須防止空氣冷卻器漏水，注意勿使冷卻水壓力大于空氣壓力，防止冷卻水進(jìn)青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 12 入空氣系統(tǒng)。 蒸汽系統(tǒng)的要求 重視飽和蒸汽的質(zhì)量，要嚴(yán)防蒸汽中夾帶大量冷凝水，防止蒸汽壓力大幅度波動，保證生產(chǎn)時所用的蒸汽壓力在 30～ 35 千帕以上。 連續(xù)滅菌設(shè)備 ： 連消塔結(jié)構(gòu)要求簡單，易于拆裝和清理，操作時蒸汽能與物料混合均勻，并易于控制溫度。 發(fā)酵罐 ： 發(fā)酵罐及其附屬設(shè)備應(yīng)注意嚴(yán)密和防止泄漏，避免形成“死角”。凡與物料、空氣、下水道連接的閥門都必須保 證嚴(yán)密度。 無菌室 ： 用超凈工作臺及凈化室代替無菌室，以提高無菌程度。 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 13 第三章 提煉工藝過程 發(fā)酵液中的雜質(zhì)如高價無機離子（ Fe2+、 Ca2+、 Mg2+）和蛋白質(zhì)在離子交換的過程中對提煉影響甚大，不利于樹脂對抗生素的吸收。如用溶媒萃取法提煉時，蛋白質(zhì)的存在會產(chǎn)生乳化，使溶媒合水相分離困難。對高價離子的去除，可采用草酸或磷酸。如加草酸則它與鈣離子生成的草酸鈣還能促使蛋白質(zhì)凝固以提高發(fā)酵濾液的質(zhì)量。如加磷酸（或磷酸鹽），既能降低鈣離子濃度，也利于去除鎂離子。 Na5P3O10 + Mg2+====MgNa3P3O1 0+ 2Na+ 加黃血鹽及硫酸鋅，則前者有利于去除鐵離子，后者有利于凝固蛋白質(zhì)。此外，兩者還有協(xié)同作用。他們所產(chǎn)生的復(fù)鹽對蛋白質(zhì)有吸附作用。 2K4Fe(CN)6 + 3ZnSO4 K2Zn[Fe(CN)6]2 + 2Na+ 為了有效的去除發(fā)酵液中的蛋白質(zhì)，需加入絮凝劑。絮凝劑是一種能溶于水的高分子化合物。含有很多離子化基團（如 — NH2， — COOH， — OH） 。 化學(xué)提取和精制的目的：從發(fā)酵液中制取高純度的、合乎藥典的抗生素成 品。 由于發(fā)酵液中 青霉素 濃度很低，僅 ～ %左右，而雜質(zhì)濃度比 青霉素 的高幾十倍甚至幾千倍，并且某些雜質(zhì)的性質(zhì)與抗生素的非常相近，因此提取精制是一件十分重要的工作。 發(fā)酵液中常見的雜質(zhì)有：菌絲、未用完的培養(yǎng)基、易污染雜菌、產(chǎn)生菌的代謝產(chǎn)物、預(yù)處理需要加入的雜質(zhì)等。 青 霉素生產(chǎn)仿真使用 手冊 地址：北京市朝陽區(qū)安外小關(guān)東里 10 號院，潤宇大廈 610 室 郵編： 100029 Email: 電話： 010－ 64951832 網(wǎng)址： 14 在提煉過程中要遵循下面四個原則： 時間短 溫度低 pH 適中 勤清洗消毒 常用的提取方法有溶媒萃取法、離子交換法和沉淀法等。 溶媒萃取法 這是利用 抗生素 在不同的 pH 值條件下以不同的化學(xué)狀態(tài)（游離態(tài)、 堿或鹽 ） 存在時，在水 及水互不相溶的溶媒中溶解度不同的特性，使 抗